Какое генетическое исследование предпочесть для подтверждения диагноза наследственного заболевания? С этим вопросом сталкиваются все врачи, назначающие генетическое обследование своим пациентам. Ответ неоднозначен прежде всего потому, что стоимость различных методов генетического исследования отличается на порядки, а обязательное медицинское страхование не покрывает соответствующее обследование.

КАКИМ ПУТЕМ ИДТИ

Конечно, хотелось бы сразу получить полное, всеобъемлющее представление о геноме и быть уверенными, что ничего не пропущено. Но оплата подобного желания не всегда по карману родителям больного. Если за анализ платит семья пациента, врач старается минимизировать траты и назначить более дешевое исследование конкретного гена или панели генов. При некоторых заболеваниях такой подход успешен, при других — заставляет семью последовательно оплачивать целый набор генетических тестов, который в конце концов завершится исследованием генома. Такой путь намного дороже и длиннее, чем первичное исследование генома. Что же предпочесть? Попробуем осветить состояние и варианты решения проблемы.

Исходно генетические изыскания проводились на уровне семей, и генетика человека многому научилась в рамках семейных исследований. Семейный подход позволил накопить информацию о редких генетических дефектах, приводящих к выраженным изменениям фенотипа (совокупности внешних и внутренних признаков организма). Как правило, эти дефекты нарушают считывание последовательностей белка, что вызывает формирование узнаваемых проявлений заболевания. По данным каталога OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man, Менделевское наследование у человека онлайн), к настоящему времени описано около 4 тысяч различных генов, формирующих фенотип подобным образом. Сегодня известно более 8 тысяч наследственных заболеваний.

Изначально представлялось, что генетический анализ легко определит однозначный и окончательный диагноз больного. Но все оказалось не совсем так: по мере накопления генетических данных и вовлечения в обследования все большего количества людей, выяснилось, что существуют не только простые и однозначные взаимосвязи генотипа и фенотипа, но и более сложные взаимодействия генов. Если сам процесс секвенирования генома перешел в разряд рутинного, то анализ и интерпретация результатов оказались очень сложной задачей со многими ограничениями и оговорками. Причем сложность состоит не в выявлении генетических вариантов (ранее вместо «варианты» говорили «мутации», то есть участки измененной ДНК) и генотипировании, а в функциональной интерпретации выявленных генетических нарушений.

ВОПРОСЫ ИНТЕРПРЕТАЦИИ

При интерпретации молекулярно-генетических заключений практикующие врачи сталкиваются со следующими трудностями:

• неоднозначность диагноза по результатам молекулярно-генетического исследования (например, выявлено несколько вариантов различных генов, которые могут приводить к развитию имеющегося заболевания);
• результаты молекулярно-генетического исследования в разных лабораториях отличаются;
• у человека без клинических проявлений заболевания имеются патогенные варианты (ложнонегативный фенотип);
• выявленный вариант конкретного гена сопровождается разным фенотипом (даже в рамках одной семьи);
• у больного с ярким фенотипом наследуемого в семье заболевания не обнаружено патогенных/вероятно патогенных вариантов;
• этические проблемы обнародования вероятности развития тяжелых наследственных заболеваний у ребенка.

Рассмотрим причины появления этих сложностей. Мутирование — это естественное свойство дезоксирибонуклеиновой кислоты (рис. 1, 2), составляющей основу генома человека. Спонтанные мутации возникают самопроизвольно на протяжении всей жизни организма в нормальных условиях окружающей среды с частотой около 10–9–10–12 на нуклеотид за одну клеточную генерацию. Мутация в соматической клетке не приводит к изменениям во всем организме, а вот в половой — вызывает изменение свойств всего организма-потомка. Мутации (рис. 3) случайны и возникают независимо от воздействия того фактора, к которому они позволяют приспособиться или, напротив, не дают этого сделать. Однако несомненно, что вероятность и возможность тех или иных мутаций зависят и от свойств конкретного генотипа (организма).

В геноме человека содержится около 20 000–25 000 активных генов (Международный консорциум по секвенированию генома, 2004). Фактически только 1,5 % всего генетического материала человека кодирует синтез белков или функциональные РНК, а остальная часть ДНК является некодирующей, но она играет важнейшую роль в поддержании целостности генома, регуляции активности и включении генов. Наши знания об этих 98,5 % генома пока еще недостаточны.

На фенотипическое проявление заболевания при возникновении мутации влияют различные факторы:

• активность многих генов подвержена влиянию извне;
• существует неоднозначная модель взаимодействия генов со своим окружением при формировании фенотипа;
• имеются возможности влияния на формирование фенотипа клетки за счет механизмов, не затрагивающих последовательности ДНК.

Наличие генов-регуляторов, эффект расположения гена, неэффективная терминация его считывания и другие эпигенетические факторы могут создавать иллюзию «здорового» больного гена.

К ключевым проблемам, которые сейчас стоят перед генетиками, относятся не только наиболее полное обнаружение всевозможных вариантов строения ДНК и точное прогнозирование функциональных эффектов этих вариантов, но и оценка влияния взаимодействия генов и эпигенетических факторов на возможность и активность прочтения гена.

Для решения этих проблем генетические исследования должны перейти на уровень анализа ресурсов биобанков, высокопроизводительных технологий анализа генома и вычислений, которые позволят оценивать большие данные (big data). В геномных исследованиях человека возникла новая парадигма: внимание специалистов привлечено к неэкзонным областям генома (которые не задействованы в кодировании последовательностей белка), к оценке взаимодействия этих областей между собой и их влиянию на белок-кодирующие участки.

РЕВОЛЮЦИЯ В ГЕНЕТИКЕ

Доступность секвенирования всего генома уже сейчас совершает революцию в области генетики человека благодаря проведению всесторонних исследований, в которых подвергаются анализу все классы вариаций в масштабе всего генома по всему спектру частот аллелей.

Что мы получим в результате этих новых технических возможностей? В идеале для нас станет понятным механизм реализации дефектов строения генов и некодирующих областей генома и их фенотипическая реализация.

Имеют ли различные варианты генетического тестирования (хромосомный микроматричный анализ — ХМА; полноэкзомное секвенирование — WES и полногеномное секвенирование — WGS, рис. 4) разную значимость в выявлении причинных мутаций у детей с подозрением на генетическое заболевание? Для ответа на этот вопрос был проведен метаанализ 37 исследований с участием 20 068 детей с подозрением на генетическое заболевание. Диагностическая ценность WGS оказалась на 14 % больше, чем WES, и была качественно (практически в 4 раза) выше, чем у ХMA. По сравнению с WES диагностическая полезность WGS с интерпретацией в медицинских научно-клинических учреждениях была качественно выше (почти на 45 %), чем у референс-лабораторий; это различие оказалось значительным среди исследований, опубликованных в последние годы. Клиническая полезность WGS была на 58,8 % выше, чем WES. Исходя из полученных результатов, авторы пришли к выводу, что WGS и WES следует рассматривать как геномные тесты первой линии для детей с подозрением на генетические заболевания.

Диагностическая ценность WGS у детей может быть значительно увеличена при исследовании трех геномов (ребенок и родители). Подобный вариант генетического исследования позволяет выявить причинный генетический дефект даже при неярко выраженных фенотипе и клинической симптоматике. В 65 % случаев это позволяет повлиять на принятие клинических решений и на клиническое ведение больного, включая изменение методов лечения, ухода и/или необходимость подключения паллиативной помощи.

Проведение WGS даст нам намного больше информации о геноме, чем нужно в настоящий момент для постановки клинического диагноза. Исследователи отметили большой разрыв между результатом биоинформатического анализа и теми сведениями, которые отражены в заключении врача-генетика. Проблема именно в избыточности информации, которая может быть небезразлична для обследуемого. Результат полногеномного анализа, который не подвергся интерпретации врачом-генетиком, почти всегда является морально травмирующим как для клинициста, так и для пациента. Это связано с тем, что у всех обследуемых обнаруживаются обширные изменения генома. Одни из них с большой вероятностью могут вызвать болезнь, другие почти наверняка будут доброкачественными, а между этими двумя крайностями располагается еще целый спектр различных градаций.

По данным медицинских публикаций, до 2,85 % фенотипически здоровых детей, подвергшихся полногеномному исследованию, имеют однозначно патологические мутации генов, которые вызовут у них симптомы заболевания в будущем. Бесспорно, оповещение о подобных результатах окажет негативное психологическое воздействие на исследуемого и его семью.

В то же время в большинстве случаев WGS позволяет своевременно ставить сложные диагнозы, которые не удается подтвердить с помощью каких-либо других диагностических инструментов. Это может способствовать раннему/ своевременному началу жизненно важного лечения пациента. Именно в связи с такими находками некоторые исследователи даже предлагают рутинное использование геномики для профилактики болезней.

ГЛАВНЫЕ ПРОБЛЕМЫ

При клиническом тестировании WGS могут возникнуть три основные проблемы.

Во-первых, пациенты и родители должны понимать ограничения секвенирования. Например, некоторые методы не выявляют транслокации, большие дупликации или делеции, повторы числа копий или избыточные повторы триплета. Когда в одном и том же гене идентифицируются две вариации, некоторые анализы WGS не могут установить, находятся ли эти вариации в копиях гена на разных хромосомах или в одной и той же копии гена. Это различие имеет решающее значение для диагностики рецессивных заболеваний.

Во-вторых, сложно поддерживать актуальную информацию обо всех известных генетических заболеваниях. Централизованного хранилища всех редких и связанных с болезнями вариантов пока не существует. Именно поэтому интерпретации разных генетических лабораторий могут отличаться.

В-третьих, доступность WGS может привести к значительному и не всегда обоснованному росту числа тестов по направлению сверхосторожных врачей. Такое увеличение не только повысит расходы на здравоохранение, но и подвергнет пациентов физическим и психологическим рискам, связанным с избыточным тестированием.

Технология WGS быстро улучшается, как и базы данных, позволяющие более точно интерпретировать результаты. Поэтому оптимизация адекватности оценки исследования полного генома — это достижимая цель.

Направление пациента на генетическое тестирование — неотъемлемая составляющая диагностики в педиатрии. Стандарт лечения часто представляет собой трудоемкий поэтапный подход, включающий хромосомный микроматричный анализ, панели генов, что не всегда приводит к обнаружению причины заболевания. WGS обеспечивает комплексную платформу для тестирования, которая может упростить оценку выявленных генетических нарушений, указать на лежащую в основе болезни генетическую поломку и облегчить интерпретацию имеющихся клинических нарушений.

При сравнении диагностических возможностей и охвата WGS с результатами генетического тестирования, имеющими меньший охват, становится очевидно, что WGS чаще позволяет выявлять причину наследственного заболевания в сравнении с такими исследованиями, как панели генов, секвенирование экзома, ХМА. Варианты структурных и неэкзонных последовательностей, а также изменения митохондриальной ДНК в подавляющем большинстве случаев могут быть обнаружены только при исследовании генома.

Так какое же генетическое исследование предпочесть? Дорогое и полное исследование генома или более дешевое с частичным покрытием страховкой? Если бы вопрос не упирался в оплату, однозначно предпочтительным было бы исследование генома с широким покрытием. Облегчить вопрос финансирования столь дорогого исследования могут благотворительные некоммерческие организации, например благотворительный фонд медико-социальных генетических проектов помощи «Геном жизни». Фонд существует два года, специализируется на финансировании полногеномного секвенирования для детей с наследственными заболеваниями, а также их родственников первой и второй степеней родства, супружеских пар и будущих мам.

Обратиться в фонд можно вне зависимости от материальной обеспеченности семьи. Для этого необходимо иметь медицинскую выписку с указанием на наследственный характер заболевания и рекомендацию врача провести исследование генома.