Создание животной модели заболевания для разработки лечения рестриктивной кардиомиопатии у ребенка

Персонализированная медицина — это сложная интегративная концепция здравоохранения. Одним из вариантов ее практической реализации стал совместный проект поиска путей лечения конкретного пациента на базе Белгородского государственного национального исследовательского университета (НИУ «БелГУ»), ОСП «НИКИ педиатрии и детской хирургии им. академика Ю.Е. Вельтищева», ООО «Марлин Биотех» и ряда других научных и медицинских центов.

КЛИНИЧЕСКИЙ СЛУЧАЙ 

Все началось с  маленького пациента с  рестриктивной кардиомиопатией (РКМП). Многие врачи предсказывали родителям скорое наступление сердечной недостаточности (СН) и необходимость в пересадке сердца. Генетическое исследование выявило мутацию, затрагивающую последовательность гена FLNC, кодирующего белок филамин С. Эта находка стала ключевым моментом для начала большой работы в попытке помочь ребенку в коррекции его патологии. Ниже представлена краткая история болезни. 

Мальчика трех лет и двух месяцев обследовали в кардиологическом отделении в связи с анамнезом легочной гипертензии и рестриктивной кардиомиопатии. Ребенок родился путем кесарева сечения на сроке 37,5 недель из-за маловодия и акинезии плода. Рост и вес при рождении — 49 см и 2785 г, оценка по шкале Апгар — 9/10. 

В 5 недель эхокардиография (ЭхоКГ) выявила множественные мелкие дефекты межжелудочковой перегородки, открытое овальное окно и признаки легочной гипертензии (ЛГ). 

В 8 месяцев проведена катетеризация сердца — данных за ЛГ не было, хотя в заключении есть цифры, указывающие на легочную венозную гипертензию (давление в легочной артерии понижено до 25 мм рт. ст. без повышения индекса сопротивления легочных сосудов). Небольшой шунт слева направо (дефект желудочковой перегородки плюс остаточный дефект предсердной перегородки), нормальное давление в левом желудочке (ЛЖ) без его обструкции. Давление RA = 6; RV = 29/6 (19,7); LPWC — 8; CI — 3,6; Qp/Qs — 1,2:1; PWR 2,3 Вт (3,97 Вт/м2 — рассчитано в НИКИ им. Вельтищева). ЭхоКГ — двустороннего увеличения нет. ЭКГ — синусовый ритм,110 уд./мин, увеличение правого предсердия, гипертрофия правого и левого желудочков (ГПЖ и ГЛЖ). 

В трехлетнем возрасте проведена вторая катетеризация сердца в связи с увеличением предсердий, выявленным при ЭхоКГ: значительное повышение давления в ЛЖ, расширение левого и правого предсердий, давление RA = 7; RV = 40/12 (среднее—26,4, рассчитано в  НИКИ им.  Вельтищева); MPA — 35/15/25; LAm — 20 мм рт. ст.; CI — 4,4; Qp/Qs — 1:1; PWR — 1,1 Wu (2 Wu/м2 ). Была диагностирована ЛГ. Рекомендовано лечение аспирином — 40,5 мг в день. 

В 2018 году было проведено полноэкзомное секвенирование у пробанда и его родителей. Вариант de novo в гене FLNC (делеция внутри рамки считывания) классифицировали как вероятно патогенный. Впоследствии две другие лаборатории повторно проанализировали необработанные данные и согласились с классификацией. Также был проведен хромосомный микроматричный анализ, который не выявил никаких изменений числа копий ДНК, имеющих известное клиническое значение. Значимых областей гомозиготности и однородительской изодисомии также не наблюдалось. 

Семейный анамнез: у  неродственных родителей есть две старшие здоровые дочери, отрицают врожденные аномалии, кардиомиопатии или нервномышечные заболевания. 

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АСПЕКТ 

Для исследования механизма развития заболевания и изучения эффективности потенциальных генотерапевтических лекарственных препаратов методом генного редактирования были созданы мыши, несущие в своем геноме мутацию, как у пациента. Для установления соответствия симптомам развития заболевания у мышей состоянию пациента были сформированы экспериментальные группы. 

Мышам проводили ультразвуковое и  электрокардиографическое исследования сердца (ЭхоКГ и ЭКГ), а также нагрузочные тесты, во время которых подопытные животные плавали в воде с утяжелением на хвосте (10 % от массы тела) для определения их общего физического состояния. 

Выявлена тенденция к сокращению времени плавания у мышей-трансгенов с достоверным его уменьшением в возрасте 6 и 8 недель, которое составило 87,25 ± 10,96 и  75 ± 7,11 с  в  группе трансгенов и 96,05 ± 10,14 и 97,59 ± 7,7 с соответственно. У мышей-мутантов FLNC зарегистрирована меньшая масса тела по сравнению с контрольной группой. Она оказалась статистически ниже в возрасте 4 и  6 недель, составив 14,94 ± 0,58 и 18,31 ± 0,51 г у диких мышей против 13,52 ± 0,79 и 17,5 ± 0,56 г у трансгенов соответственно. 

Основным методом исследования как у  человека, так и  у  мышей является ЭхоКГ, проводившаяся у  животных с 4 недель, когда те весят менее 15 г. У трансгенов с 5-недельного возраста выявлены изменения ультразвуковых параметров, характеризующих диастолическую функцию сердца (ДФС), что свидетельствует о нарушении расслаблении ЛЖ у мышей. Именно эти изменения подтверждают развитие РКМП у животных. Если в 5 недель среднее соотношение Е/А, характеризующее ДФС, составило 2,11, то с возрастом оно увеличивалось, достигнув 2,28 в 24 недели. В это же время у мышей без мутации оно составило 1,83. По  сравнению с группой контроля IVRT уменьшился с 6,61 ± 0,46 мс до 4,32 ± 0,21 мс (р < 0,05) в группе трансгенов. Выявлено достоверное снижение DT: у диких мышей 14,91 ± 0,26 мс против 12,42 ± 0,313 мс у трансгенов. Кроме того, у трансгенных мышей выявлено уменьшение конечно-систолического и  конечнодиастолического размера и объема ЛЖ при сохраненной фракции его выброса. 

Конечный диастолический размер ЛЖ был достоверно меньше у мышеймутантов FLNC по сравнению с контрольной группой (что указывает на меньший размер сердца). В группе контроля он составил 2,71 ± 0,05 см, 2,8 ± 0,05 см, 2,86 ± 0,04 см, 3,0 ± 0,05 см, а у трансгенов — 2,57 ± 0,06 см, 2,67 ± 0,06 см, 2,71 ± 0,05 см, 2,79 ± 0,05 см в возрасте 4, 5, 6, 8 недель соответственно. Выявлено уменьшение конечного систолического размера ЛЖ, составившего в группе контроля 1,86 ± 0,04, 1,91 ± 0,04, 1,96 ± 0,03, 2,06 ± 0,04, а у трансгенов — 1,75 ± 0,04, 1,83 ± 0,04, 1,85 ± 0,03, 1,93 ± 0,04 в возрасте 4, 5, 6, 8 недель соответственно. 

Конечно-диастолический объем ЛЖ был достоверно меньше в  возрасте 4, 5, 6 и 8 недель, составив в группе контроля 0,056 ± 0,003 см3 , 0,061 ± 0,003 см3 , 0,065 ± 0,003  см3, 0,074 ± 0,004  см3, а  в  группе трансгенных животных — 0,048 ± 0,003 см3 , 0,053 ± 0,003 см3 , 0,057 ± 0,005 см3 , 0,06 ± 0,003 см3 соответственно. Наблюдалось достоверное уменьшение конечно-систолического объема ЛЖ: 0,02 ± 0,001 см3 , 0,021 ± 0,001 см3 , 0,022 ± 0,001 см3 , 0,026 ± 0,001 см3 в группе контроля против 0,017 ± 0,002 см3 , 0,019 ± 0,001 см3 , 0,019 ± 0,001 см3 , 0,021 ± 0,001 см3 в группе трансгенов в возрасте 4, 5, 6, 8 недель соответственно при сохраненной фракции выброса и фракции укорочения. Достоверных различий в толщине межжелудочковой перегородки в диастолу или толщине задней стенки ЛЖ не выявлено. 

При исследовании диастолической функции сердца установлено, что соотношение Е/А составило 1,93 ± 0,03, 1,95 ± 0,03, 1,95 ± 0,03, 1,9 ± 0,04 в группе контроля против 2,02 ± 0,07, 2,01 ± 0,05 (р < 0,05), 2,12 ± 0,05 (р < 0,05), 2,11 ± 0,05 (р < 0,05) в группе трансгенов. IVRT по сравнению с группой контроля (6,37 ± 0,32 мс, 6,39 ± 0,31 мс, 6,08 ± 0,23 мс, 6,44 ± 0,24 мс) уменьшился до  6,32 ± 0,43 мс, 5,34 ± 0,05 мс (р < 0,05), 4,92 ± 0,23 мс (р < 0,05), 4,86 ± 0,26 мс (р < 0,05) в группе трансгенов в возрасте 4, 5, 6, 8 недель соответственно. Достоверное увеличение DT выявлено в возрасте 8 недель и составило у диких мышей 14,8 ± 0,25 мс против 13,49 ± 0,33 мс у трансгенов. В возрасте 6 и  8 недель зарегистрировано достоверное увеличение размеров левого предсердия, которое составило в группе контроля 1,11 ± 0,03 см и 1,14 ± 0,03 см, а в исследуемой группе — 1,17 ± 0,03 см и 1,24 ± 0,04 см соответственно. 

При анализе ЭКГ длительность зубца Р была больше в трансгенной группе, достигнув статистической значимости в  возрасте 5 недель, а  именно 15,5 ± 1,57 мс в группе контроля и 20,0 ± 2,38 мс в группе трансгенов (р < 0,05). 

Еще одним важным исследованием было измерение внутрижелудочкового давления. У  18-недельных мышей диастолическое давление составляло 10,5 мм рт. ст. до и 16,5 мм рт. ст. (p < 0,05) после введения адреналина, в контрольной группе этот показатель равнялся 7,2 мм рт. ст. и 7,6 мм рт. ст. соответственно, что подтверждает развитие РКМП. 

Морфологические изменения, выявленные при гистологическом исследовании в группе трансгенов, имеют разнонаправленный характер и заключаются в  дискоординированном нарастании значений анализируемых морфометрических показателей. Такие морфологические изменения, как локальные участки с жировой тканью, разрастание соединительной ткани, клеточная инфильтрация, изменение интенсивности окраски цитоплазмы кардиомиоцитов и их размеров, свидетельствуют о наличии РКМП. 

В  возрасте 24 недель у  мышей выявлены следующие патоморфологические изменения. 

1) Выраженное нарушение микроархитектоники миокарда с очагами неупорядоченности как клеточных цепочек (волокон), так и отдельных кардиомиоцитов.
2) Гипертрофия кардиомиоцитов, часто асимметричного характера, придающего клеткам причудливый вид и топографически ассоциированная с интерстициальным фиброзом. При этом отмечались полиморфизм и гиперхроматоз ядер, миофибриллярные дистрофические изменения кардиомиоцитов.
3) Эндокардиальный и миокардиальный фиброз вышеописанных типов.
4) Интерстициальные изменения миокарда в виде межмиоцитарных скоплений аморфного матрикса, что соответствует представлениям об инфильтративных кардиомиопатиях. При этом отсутствие вторичного морфологического субстрата (амилоидоз, болезни накопления, эктопические клеточные инфильтраты) дает основание рассматривать выявленные поражения как идиопатические.
5) Микрососудистые изменения в виде проявлений фиброза стенок артериол и мелких артерий, эндотелиальной пролиферации и сужения сосудистых просветов вследствие этих изменений. 

Сопоставление с данными крупных обобщающих работ о патоморфологических критериях генетически детерминированных кардиомиопатий свидетельствует о том, что у изученных особей есть следующие соответствия критериям рестриктивной кардиомиопатии. 

Макроскопически 

1. Дилатация предсердий при отсутствии дилатации и (или) гипертрофии желудочков.
2. Сужение просвета правого желудочка как за счет эндокардиального интрамурального фиброза, так и выявленной нами асимметричной правосторонней гипертрофии межжелудочковой перегородки. 

Микроскопически 

3. Эндокардиальный и интрамиокардиальный фиброз: и то и другое относится к главным признакам.
4. Нарушение микроархитектоники миокарда.
5. Миофибриллярные дистрофические изменения кардиомиоцитов. 

Выявленные асимметричная гипертрофия кардиомиоцитов и микрососудистые изменения строго не укладываются в критерии, предложенные на основании многочисленных работ. Вероятнее всего, они имеют вторичный характер, так как топографически ассоциированы с  миокардиальным фиброзом. Кроме того, необходимо учитывать, что при одном типе генетических нарушений возможны частичные проявления других фенотипических вариантов из общего спектра кардиомиопатий. Полученные результаты позволяют считать мышей адекватной персонализированной моделью рестриктивной кардиомиопатии конкретного пациента и использовать их для скрининга генотепавертических препаратов