Аллогенные эритроциты пуповинной крови в лечении анемии недоношенных

Самый распространенный метод лечения анемии новорожденных — внутривенное переливание эритроцитов от взрослых доноров. Благодаря своей форме эритроциты обладают способностью к обратимой деформации при прохождении через узкие изогнутые капилляры. Геометрия — определяющий фактор обратимой деформируемости эритроцитов, времени выживания, осмотической устойчивости и поглощения кислорода.

Неонатальные эритроциты (НЭ) и эритроциты взрослых (ЭВ) по средней толщине, индексу площади поверхности и осмотической резистентности существенно не отличаются, тогда как объем НЭ на 21 %, площадь их поверхности — на 13 %, а диаметр — на 11 % больше ЭВ. Отношение площади поверхности к объему НЭ составляет 1,42 ± 0,08, а взрослых эритроцитов—1,49 ± 0,06. Минимальный цилиндрический диаметр НЭ равняется 3,04 ± 0,25, а взрослых эритроцитов — 2,81 ± 0,23 микрона. 

Значительное увеличение соотношения холестерина и фосфолипидов (С/Ф) в ЭВ рассматривается как основная причина снижения эластичности донорских эритроцитов. Сочетание пониженной деформируемости ЭВ и повышенного числа капиллярных проходов в кровообращении младенцев может вызвать кумулятивное механическое повреждение ЭВ, способное приводить к сокращению выживаемости ЭВ в кровообращении младенцев с низкой массой тела, тем самым увеличивая количество трансфузий. 

У новорожденных продолжительность жизни перелитых как ЭВ, так и НЭ была намного короче 120 дней. Это доказывает, что среда, в которой циркулируют ЭВ в системе кровообращения младенцев, является одним из основных факторов, существенно сокращающих их выживаемость. Кроме того, продолжительность жизни ЭВ составила 70 дней против 50 дней НЭ. Это значит, что некоторая разница во внутренних характеристиках двух популяций эритроцитов служит значимым, но менее важным фактором, определяющим продолжительность жизни. Благодаря высокой концентрации фетального гемоглобина (HbF), который практически отсутствует в ЭВ, эритроциты пуповины обладают потенциалом доставлять физиологически подходящее количество кислорода к тканям плода и новорожденного при переливании. В отличие от ЭВ эритроциты пуповинной крови быстро портятся при традиционном хранении при температуре 1–6 °C. 

Таким образом, было бы полезно сохранять их при низкой температуре. При сравнении реологических свойств замороженных эритроцитов с высоким содержанием глицерина и после оттаивания, хранившихся во взвешивающем растворе SAG-M, со свойствами обычно хранящихся в жидкости и свежих эритроцитов S. Henkelman с соавт. (2010) показала, что размороженные эритроциты более хрупкие, чем свежие, хранящиеся традиционным способом в жидкости. Однако процесс замораживания, оттаивания и отмывания не оказал негативного влияния на агрегируемость и деформируемость, а также на содержание АТФ в размороженных эритроцитах. Благодаря реологическим свойствам криоконсервированные эритроциты являются ценной альтернативой эритроцитам, хранящимся в жидкости. 

СОБСТВЕННЫЕ ДАННЫЕ 

В перинатальном центре ГКБ им. Л.А.Ворохобова и родильном доме ГКБ № 31 им. академика Г.М.Савельевой Департамента здравоохранения Москвы (ДЗМ) выполнили сбор пуповинной крови у 240 рожениц с доношенной беременностью (37–40 недель) без медицинских противопоказаний к сдаче пуповинной крови, давших информированное согласие на сбор пуповинной крови для неперсонифицированного хранения эритроцитов и соответствовавших критериям: 

• пункта 2 приложения 1 к приказу ДЗМ от  08.12.2003  г. №  702 «Об  организации работы ГУЗ “Банк стволовых клеток” ДЗМ»; 
• пунктов 2 и 5 приложения 1 к приказу Минздрава России 25.07.2003 г. № 325 «О  развитии клеточных технологий в Российской Федерации»; 
• пункта 19 Порядка оказания медицинской помощи при заболеваниях (состояниях), для лечения которых применяется трансплантация (пересадка) костного мозга и  гемопоэтических стволовых клеток, утвержденного приказом Минздрава России от 12.12.2018 г. № 875н «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи при заболеваниях (состояниях), для лечения которых применяется трансплантация (пересадка) костного мозга и гемопоэтических стволовых клеток, и внесении изменения в Порядок оказания медицинской помощи по профилю "хирургия (трансплантация органов и (или) тканей человека)", утвержденный приказом Минздрава России от 31 октября 2012 г. № 567н». 

Цельную пуповинную кровь, собранную в закрытую систему с антикоагулянтом цитратом-фосфатом-декстрозой-аденином (CPDA-1–30 и 50 мл; JMS Bionic Medizintechnik, GmbH; Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd), хранили при комнатной температуре от 12 до 48 часов, а затем доставляли с соблюдением условий температурного режима и обрабатывали в ГБУЗ «Центр крови им О.К. Гаврилова» ДЗМ. 172 образца пуповинной крови исследовали на стерильность, наличие вирусных инфекций методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), выполнили серологическое определение группы крови по системе АВО, резуспринадлежности, антигена эритроцитов К1 системы Kell, антигенов эритроцитов С, с, Е, е, антиэритроцитарных антител, а также провели генетическое типирование антигенов эритроцитов. Результаты анализа распространенности антигенов системы АВО в пуповинной крови указывают на преобладание группы крови А (II) — 44 %, далее следуют O (I) — 27 %, B (III) — 25 % и AB (IV) — 6 %. Распространенность антигена A2 в образцах групп крови А (II) и AB (IV) составила 93 %, а антигена А1 — около 7 %. Частота встречаемости антигена Kell составила 9 %. 

Эритроциты пуповинной крови были получены после выделения лейкоцитарной фракции с помощью набора Kit CS 530.1 на клеточном сепараторе Sepax S-100 (Biosafe, Швейцария). Для эффективной защиты при замораживании и размораживании эритроцитов использовался метод быстрой заморозки при ультранизких температурах в парах жидкого азота с ограждающим раствором, содержащим глицерин (20 %) в рабочей концентрации. После смешивания эритроцитов с ограждающим раствором выжидали не менее 15 мин (для полного проникновения глицерина в эритроциты) и только после этого переходили к замораживанию. Если выжидать меньше 15 мин, большинство эритроцитов может погибнуть при замораживании и оттаивании. Однако нежелательно и увеличение времени выжидания, так как это повышает вероятность проявления токсических эффектов глицерина в отношении эритроцитов, которые возникают при комнатной температуре. В результате большинство эритроцитов могут быть повреждены или гемолизированы еще до начала процесса замораживания. 

111 образцов глицеролизированных пуповинных эритроцитов объемом от 20 до 80 мл помещали в мешки для глубокой заморозки клеток и тканей (OriGen Biomedical Inc.) с длительным хранением в криогенном оборудовании. При анализе объема замороженной эритроцитной массы обнаружились потери клеточного компонента в количестве 5–50 % от начала продецуры выделения эритроцитов и до окончания глицеролизации. По данным литературных источников, соотношение объема цельной крови взрослых к объему раствора антикоагулянта / консерванта составляет 7:1 и является важным фактором, влияющим на качество эритроцитов. 

Поскольку гематокрит пуповинной крови измеряли после ее смешивания с антикоагулянтом, его показатель частично характеризует отношение объема пуповинной крови к объему антикоагулянта. В исследовании M. Zhurova с соавт. показано, что более низкий гематокрит пуповинной крови коррелировал с более низкой деформируемостью эритроцитов. 

В нашем исследовании соотношение (кровь: CPDA-1) колебалось от 0,8:1 до 5,8:1 из-за непредсказуемости объема собираемой пуповинной крови. При небольших ее объемах соотношение окажется низким, pH будет снижаться, что приведет к повреждению эритроцитов на ранних этапах хранения. 

Клиническая эффективность криоконсервированных эритроцитов во многом зависит от сохранения их полноценного качества, в том числе при разморозке. Несмотря на наличие протоколов деглицеролизации ЭВ, методики оттаивания и отмывания эритроцитов пуповинной крови от криопротектора не разработано. Для изучения влияния криоконсервирования на качественные и количественные характеристики деглицеролизированных эритроцитов было разморожено 38 образцов криоконсервированных НЭ. Длительность их хранения до размораживания составила от 25 до 106 дней. 

Морфофункциональное состояние деглицеролизированных эритроцитов оценивалось с помощью комплекса лабораторных методик, включающих определение объема конечного продукта, гемоглобина (грамм в 10 единицах), гемоглобина в надосадочной жидкости (грамм в единице), гематокрита (%), осмолярности (мОсм/л), остаточного количества лейкоцитов в единице, среднего объема эритроцита, средней концентрации гемоглобина в эритроците. Криомешки, содержащие глицеролизированные пуповинные эритроциты, размораживали при +37 о С и отмывали от криопротектора методом серийного центрифугирования. Основываясь на опыте работы Центра крови им О.К. Гаврилова при размораживании и отмывании донорских эритроцитов методом центрифугирования и выполнив ряд экспериментов, мы определили оптимальное количество серий и режимов центрифугирования, а также объемы растворов, необходимых для снижения осмолярности (растворы 12 %-го хлорида натрия и 0,9 %-го хлорида натрия с 0,2 %-й глюкозой), и солевого раствора с аденином, глюкозой и маннитолом (SAG-M). Объем конечного клеточного продукта составил от 30 до 60 мл, содержание гемоглобина в 10 единицах было 1,6 г, показатель гематокрита — 54–59 %, осмолярность удалось снизить до 363– 370 мОсм/л, уровень гемоглобина в надосадочной жидкости равнялся 0,01 г/л, средний объем эритроцита — 120– 130 мм3 , средняя концентрация гемоглобина в эритроците — 267–284 г/л. Все исследованные образцы размороженных отмытых эритроцитов пуповинной крови соответствовали требованиям значений показателей безопасности эритроцитной взвеси, размороженной и отмытой согласно ПП РФ от 22.06.2019 г. № 797 в объеме компонента, необходимом для переливания недоношенным новорожденным (10 мл/кг). 

Предлагаемый метод заготовки эритроцитов пуповинной крови позволит эффективно и безопасно проводить гемотрансфузионную терапию у новорожденных различного гестационного возраста с анемией. Метод может быть доступен для применения во всех акушерских и неонатальных стационарах, не требует уникального оборудования и прост в технологическом воспроизведении. 

Список литературы находится в редакции