Молекулярные маркеры эндотелиальной дисфункции при неонатальном сепсисе

Несмотря на все научные достижения, мы пока еще не до конца понимаем сложные иммунные механизмы, регулирующие патофизиологию неонатального сепсиса (НС). Хотя фундаментальные и трансляционные исследования пролили некоторый свет на особенности неонатального иммунного ответа при сепсисе, их данные крайне противоречивы. Непонимание патофизиологии иммунной системы новорожденного препятствует раз работке новых подходов к профилактике и терапии НС, необходимость в которых очевидна.

ВАЖНЫЕ ОТЛИЧИЯ

Наши знания об анатомии и функциях иммунной системы у детей раннего возраста значительно улучшились за последние несколько десятилетий. Иммунный ответ новорожденных на экзогенные факторы, такие как патогенные микроорганизмы и иммунобиологические препараты, имеет отличительные особенности по сравнению со взрослыми, в том числе:

• выраженное преобладание врожденных иммунных механизмов даже в клетках, классически считающихся «адаптивными», таких как CD8+ Т-клетки;
• снижение хемотаксиса и фагоцитарной активности полиморфноядерных гранулоцитов и моноцитов в условиях стресса in vitro;
• снижение провоспалительной активности и Th1‑поляризации антигенпрезентирующих клеток (АПК) и лимфоцитов, характеризующееся слабой продукцией интерлейкина (ИЛ) 12р70, γ-интерферона (γ-ИФН) и фактора некроза опухоли-α (ФНО-α) в ответ на вакцинацию;
• относительно высокая продукция IL‑17 и IL‑23, характерных для Th2-Th17‑поляризации иммунного ответа, IL‑6 и IL‑10, особенно у недоношенных новорожденных;
• высокая значимость иммуномодулирующих факторов, таких как материнские антитела, высокие концентраци аденозина и сниженные — комплемента.

При обследовании взрослых пациентов значительное внимание уделяется эндотелию сосудов (ЭС), поскольку появляется все больше данных о его роли в патофизиологии сепсиса и сепсис-ассоциированного повреждения внутренних органов. ЭС контактирует с лейкоцитами, растворимыми медиаторами, патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (ПАМП), участвующими в патогенезе сепсиса, и реагирует на них. ЭС играет важную роль в регуляции сосудистой проницаемости, модуляции местных воспалительных реакций и, в конечном счете, в развитии и прогрессировании сепсис-ассоциированной полиорганной недостаточности. В то же время роль ЭС в патофизиологии неонатального сепсиса изучена крайне мало, что лишает клиницистов возможностей мониторинга эндотелиальной функции у новорожденных из группы высокого риска и использования потенциальных иммунотерапевтических стратегий, нацеленных на ЭС (рис. 1).

ОСОБЕННОСТИ ОТВЕТА

Сепсис у взрослого определяется как угрожающее жизни нарушение функций органов, вызванное неуправляемым ответом носителя на инфекцию. Критерии сепсиса у взрослых не позволяют диагностировать НС, что отражает возрастные особенности взаимодействия организма и патогена. Более того, сегодня нет единого определения НС. Общая заболеваемость ранним НС с положительным посевом крови составляет в среднем 0,98 на тысячу живорожденных и до 1,4–4 случаев на 1000 живорожденных у детей с очень низкой и экстремально низкой массой тела при рождении. Поздний неонатальный сепсис имеет более вариабельную частоту и составляет до 30 % у новорожденных с экстремально низкой массой тела при рождении.

Наиболее высока смертность при сепсисе, вызванном грамотрицательными бактериями, причем более половины (50–57 %) новорожденных умирают в течение первых 3 дней после дебюта сепсиса. Эти данные демонстрируют важность острой фазы в формировании исходов НС.

Интересно, что смертность взрослых пациентов с сепсисом в острой фазе значительно снизилась за последние 20 лет. Большинство летальных исходов происходит через несколько недель или даже лет после септического эпизода. По-видимому, это связано с длительно сохраняющимися иммунологическими, метаболическими и биохимическими аберрациями, входящими в понятие «сепсис-индуцированная иммуносупрессия » (СИИ), или «синдром персистирующего воспаления, иммуносупрессии и катаболизма» (СВИК). Данные о возможных иммунопатологических реакциях у новорожденных с сепсисом, похожих на таковые у взрослых пациентов, ограниченны, но с эпидемиологической точки зрения это различие подчеркивает важность возраст-ориентированных исследований патогенеза сепсиса.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С МИКРООРГАНИЗМАМИ

При сепсисе с положительным посевом крови первым ключевым событием является системная диффузия микроорганизма из очага инфекции ввиду дефекта локального иммунного ответа. Неспособность элиминировать патогены является одной из наиболее характерных особенностей врожденного иммунного ответа новорожденных. У них снижены миграция полиморфноядерных лейкоцитов к очагу инфекции, экспрессия MHC– II антигенпрезентирующими клетками, фагоцитарная активность мононуклеаров, показатели респираторного взрыва и образование нейтрофильных внеклеточных ловушек (NETs), чему также способствуют растворимые соединения — ингибиторы NETs. Все эти особенности наиболее ярко выражены у недоношенных новорожденных.

Как только происходит диссеминация бактерий в кровотоке, у новорожденных в среднем обнаруживается гораздо более высокая нагрузка микроорганизмами на 1 мл крови по сравнению со взрослыми — до 1000 КОЕ/мл против 50 КОЕ/мл. Более высокая бактериальная нагрузка у новорожденных с сепсисом может быть следствием стратегии толерантности к микроорганизмам, активно осуществляемой иммунной системой ребенка. Эволюционная толерантная стратегия экономии энергоресурсов организма по сравнению с устойчивым к инфекциям фенотипом позволяет новорожденным избегать перехода в катаболическое состояние и выгодна для установления симбиотического взаимодействия с микробиотой.

Кроме того, толерантность к микроорганизмам соответствует преобладанию Т-регуляторной и противовоспалительной функции, продемонстрированной у плода и новорожденного. Тем не менее, учитывая высокие показатели заболеваемости и смертности от НС, необходимо получить дополнительные, более убедительные доказательства, прежде чем можно будет применять концепцию эволюционно благоприятной стратегии толерантности в данном контексте.

СИСТЕМНАЯ РЕАКЦИЯ

У новорожденных, как и у взрослых, бактериальная диссеминация сопровождается системной воспалительной реакцией. Как показывают противоречивые данные целого ряда исследований, диагностика и оценка выраженности системного воспалительного ответа при НС — далеко не тривиальная задача.

Во-первых, моноциты и дендритные клетки новорожденных продуцируют меньшее количество TNF, IL‑1β и IFN-γ по сравнению с клетками взрослых при стимуляции, но равные или даже более высокие концентрации цитокинов, стимулирующих Th17 (IL‑23, IL‑6). В моделях полимикробного сепсиса у новорожденных животных продемонстрированы более низкие абсолютные концентрации в плазме TNF-α, IL‑1α/β, IL‑12, GM–CSF, CCL5, воспалительного белка макрофагов‑1β (MIP‑1β) и IFN-γ по сравнению со взрослыми при заражении сопоставимыми летальными дозами «кишечной суспензии». И, наоборот, ряд авторов подтверждают концепцию выраженного системного воспалительного ответа у новорожденных. Во-первых, было установлено, что у новорожденных (как у здоровых, так и больных сепсисом) по сравнению со взрослыми уровень IL‑18 выше и сильно коррелирует с заболеваемостью и смертностью при НС.

Во-вторых, другие цитокины — ИЛ‑6 и ИЛ‑10, последний из которых является важным растворимым медиатором для разрешения воспалительной реакции, по-видимому, продуцируются новорожденными с сепсисом в больших количествах по сравнению со взрослыми пациентами.

В-третьих, более высокая смертность и повышенные уровни TNF, IL‑6 и MCP‑1 в плазме были зарегистрированы у новорожденных мышей, которым вводили действительно равную дозу (рассчитанную на 1 грамм массы тела) чистого бактериального липополисахарида (ЛПС) по сравнению со взрослыми мышами. В целом клинические и экспериментальные исследования подчеркивают сложность и неоднозначность системного воспалительного ответа у новорожденных.

Недостающей частью этой головоломки, по крайней мере в том, что касается НС, является роль ЭС при системном воспалительном ответе. ЭС находится на перекрестке между патогеном, воспалительной реакцией, системой гемостаза и повреждением органов.

СТРУКТУРА ЭНДОТЕЛИЯ

Эндотелий как элемент сосудистой стенки представлен монослоем клеток, для которого характерны:

• пограничное положение;
• отсутствие межклеточного вещества;
• расположение клеток на базальной мембране;
• наличие системы особых межклеточных контактов, осуществляющих непрерывность клеточной выстилки. Гликокаликс вырабатывается эндотелием и располагается в критической зоне раздела тока крови и эндотелиальных клеток.

Межклеточные соединения ЭС включают кадгерины — основной класс молекул клеточной адгезии, обеспечивающих кальций-зависимое гомофильное соединение клеток в плотных тканях организма. Кадгерины представляют собой гликопротеины поверхностной адгезии, которые образуют специфическую структуру и связаны с нижележащими компонентами цитоскелета, такими как β-катенин. Плотные соединения, напротив, занимают апикальную часть межклеточного пространства и состоят преимущественно из отдельных белковых филаментов, окклюдина и клаудина.

В совокупности кадгерины и плотные соединения герметизируют межклеточное пространство ЭС и регулируют парацеллюлярный поток жидкости и растворенных веществ, возникающий пассивно в результате онкотического и гидростатического давления с обеих сторон эндотелиального слоя по принципу Старлинга. Трансцеллюлярный путь молекул, напротив, является активным процессом, который требует либо клеточной фенестрации, либо транспортной системы посредством внутриклеточных везикул.

Помимо кадгеринов целый ряд других белков адгезии способствует целостности сосудистого эндотелиального барьера, таких как молекулы межклеточной адгезии‑1 (ICAM‑1, CD54), ICAM‑2, PECAМ‑1 (CD31), CD34 и эндоглин. На апикальной поверхности, обращенной в просвет сосуда, ЭC экспрессируют трансмембранные гликопротеины, опосредующие первый контакт ICAM‑2, PECAM‑1 и VCAM‑1 с интегринами, экспрессированными на лейкоцитах. Некоторые аспекты структуры и физиологии эндотелия у новорожденных, особенно у недоношенных, отличаются от таковых у взрослых и могут играть важную роль в патогенезе неонатального сепсиса. Эндотелиальные клетки плода до 22 недель гестации не экспрессируют Р-селектин, а внутриклеточные концентрации Р-селектина у недоношенных новорожденных составляют менее половины от концентраций у доношенных. Это, в свою очередь, способствует наблюдаемому дефекту адгезии и миграции нейтрофилов у новорожденных. Экспрессия Е-селектина достигает уровня взрослых к 32‑й неделе гестации.

Кроме того, существуют различия между взрослыми и новорожденными в том, что касается метаболизма эндотелия: эндотелиальные клетки взрослого человека экспрессируют более высокие концентрации ферментов, нейтрализующих активные формы кислорода (АФК), такие как супероксиддисмутаза 2 (SOD2) и каталаза, в ответ на гипергликемию. Это исследование хорошо демонстрирует потенциальную эпигенетическую разницу между неонатальным и взрослым ЭС в способности нейтрализовать АФК. Учитывая, что как АФК, так и реактивные формы азота способствуют дисфункции эндотелия, увеличивают проницаемость клеточной стенки и индуцируют прокоагулянтное состояние, можно предположить, что сниженная нейтрализующая способность ЭС у новорожденных может играть роль в развитии эндотелиальной метаболической дисфункции при сепсисе.

Наконец, необходимо принять во внимание концепцию, касающуюся исследования эндотелиальных клеток in vitro, которая должна способствовать проведению именно возраст-ориентированных исследований. Модели in vitro для исследования ЭС новорожденных должны тщательно воспроизводить все специфичные для возраста микрофизиологические условия, чтобы более точно моделировать возрастную биологию, тем самым способствуя трансляционным исследованиям.

Над поверхностью эндотелиальных клеток и непосредственно в контакте с кровью находится гликокаликс — многослойная структура гликопротеинов толщиной 0,1–3 мкм, функции которой заключаются в том, чтобы скрывать большую часть молекул адгезии, экспрессируемых эндотелиальными клетками, поддерживать избирательную проницаемость эндотелиального барьера, регулировать гемостаз и служить своеобразным механотрансдуктором между кровотоком и стенкой эндотелиальных клеток.

Гликопротеины и протеогликаны формируют основу гликокаликса. Гликопротеины, как правило, это то, что мы себе представляем как рецепторы на поверхности клетки: селектины, интегрины и другие функционально-динамические белки клеточной поверхности. Протеогликаны играют роль стромы гликокаликса и состоят из стволовых белков, плотно прикрепленных к клеточной мембране, к которым, в свою очередь, прикрепляются отрицательно заряженные боковые цепочки гликозаминогликанов (ГАГ). Протеогликаны различаются по размеру своих протеиновых основ, количеству прикрепленных ГАГ и способам крепления к мембране клетки. Некоторые протеины гликокаликсной основы прочно прикреплены к мембране клетки посредством мембранно-связующего домена (синдеканы), другие — с помощью гликозилфосфатидилинозитолового якоря (глипиканы). Остальные белки основы: перлеканы, версиканы, декорины, бигликаны и мимеканы — секретируются после прикрепления боковых цепей ГАГ.

Исследования, непосредственно изучающие биологическую структуру эндотелиального гликокаликса сосудов как у плода, так и у недоношенных новорожденных, пока отсутствуют.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРИ СЕПСИСЕ

Эндотелиальные клетки и гликокаликс играют активную роль в воспалительных процессах и имеют глубокую функциональную связь с иммунной системой. Кроме того, эндотелий участвует в регуляции процесса свертывания крови. Это еще один фундаментальный эпифеномен системного воспаления и инфекций: триаду «эндотелий, иммунный ответ, коагуляционный каскад» следует рассматривать как единое целое и в условиях физиологической нормы, и при системном воспалительном ответе.

Благодаря своему апикальному положению гликокаликс первым сталкивается с циркулирующими микроорганизмами и растворенными в крови молекулами. Было показано, что гликокаликс разрушается в присутствии нескольких факторов, таких как АФК, бактериальный эндотоксин (ЛПС), гипергликемия, гиповолемия или провоспалительные цитокины, особенно TNF-α и IL‑1β. Этот процесс опосредуется либо прямым повреждением структурных компонентов, либо действием протеолитических и гликолитических ферментов, таких как гепариназа-I и металлопротеиназы (ММП). В частности, гепариназа-I преформирована в цитоплазматических гранулах эндотелиальных клеток и может высвобождаться при стимуляции либо цитокинами, либо эндотоксином.

Нарушение структуры гликокаликса имеет четыре основных последствия для ЭС (рис. 2):

1. Повышенная проницаемость эндотелия для белков, в том числе альбуминов, а следовательно, и для свободной жидкости.
2. Воздействие молекул адгезии на поверхности эндотелиальных клеток способствует захвату и активации иммунных клеток: активированные нейтрофилы, в частности, также могут вносить определяющий вклад в диффузный тромбоз микрососудов.
3. Увеличение диаметра микрососудов в тех участках, где гликокаликс более поврежден, что приводит к негомогенной перфузии капиллярного русла.
4. Потеря контроля над передачей сигналов от структуры гликокаликса к эндотелиальным клеткам, что способствует потере реактивности сосудистой стенки.

Убедительные доказательства роли деградации гликокаликса в патофизиологии НС отсутствуют, но важность данного фактора можно обоснованно заподозрить, учитывая, что клиническое течение НС и септического шока характеризуется системной гипотензией, гипоальбуминемией, диффузным отеком, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием и, в конечном счете, полиорганной недостаточностью. Гипоальбуминемию и гипотензию при НС часто лечат инфузией альбумина в попытке повысить внутрисосудистое онкотическое давление, несмотря на отсутствие научного обоснования. Ведь у новорожденных с сепсисом альбумин может не вызывать желаемого эффекта, а вместо этого дополнительно способствовать оттоку жидкости во внесосудистое пространство. Роль эндотелиального гликокаликса в этих случаях еще предстоит изучить.

Наконец, циркулирующий гепарансульфат, конечный продукт повреждения гликокаликса, может вызывать сильную провоспалительную реакцию и митохондриальную дисфункцию в кардиомиоцитах. Дисфункция миокарда является одним из ключевых медиаторов системной гипотензии и гипоперфузии органов в контексте неонатального септического шока. Учитывая влияние конечных продуктов гликокаликса на кардиомиоциты, представляется важным охарактеризовать то, как эти циркулирующие молекулы воздействуют на функцию миокарда у новорожденных с сепсисом.

Эндотелиальные клетки непосредственно вовлечены в патофизиологию сепсиса и могут выполнять ряд иммунных функций. Клетки эндотелия экспрессируют широкий спектр молекул, включая TLR, RIG-I-подобные и NOD-подобные рецепторы, которые напрямую взаимодействуют с различными ПАМП.

Как и в случае c АПК, активация эндотелиальных клеток индуцирует продукцию цитокинов и хемокинов. У новорожденных с сепсисом высокие концентрации в плазме IL‑1β, IL‑6, CXCL8 (IL‑8), TNFα и G-CSF не коррелируют с повышением уровня соответствующей мРНК лейкоцитов. Это позволяет предположить, что клетки, отличные от лейкоцитов, могут способствовать выработке этих провоспалительных медиаторов. Неонатальный сепсис характеризуется высокими уровнями IL‑6, CXCL8 и IL‑18 в плазме крови. Как у человека, так и в экспериментальных моделях на животных показано, что значительное количество этих провоспалительных цитокинов может продуцироваться активированными эндотелиальными клетками (ЭК). Например, и IL‑18, и IL‑18R экспрессируются ЭК, ассоциированными с атеромой, в то время как IL‑6 и CXCL8 продуцируются в значительных количествах ЭК, стимулированными ЛПС, агонистами TLR2‑рецепторов или другими циркулирующими провоспалительными цитокинами, такими как IL‑1.

Необходима дальнейшая характеристика эндотелиальных провоспалительных цитокинов при НС, а также определение эффектов терапии, направленной на индуцированную цитокинами активацию эндотелия.

СОЗДАНИЕ ГРАДИЕНТА

Локальный эффект эндотелиальных цитокинов заключается в создании градиента, направляющего нейтрофилы и моноциты к периферическим тканям. Этот эффект, по-видимому, слабо выражен у новорожденных с сепсисом по сравнению со взрослыми, а также у недоношенных новорожденных по сравнению с доношенными. Исследования in vitro показали, как хемотаксис и трансмиграция нейтрофилов нарушены у новорожденных с сепсисом из-за сниженной экспрессии молекул адгезии (в основном E-селектина, P-селектина и ICAM‑1) на эндотелиальных клетках и их соответствующих лигандов на лейкоцитах. Это, в свою очередь, может быть связано со снижением продукции ФНО-α в условиях системного воспалительного ответа. Интересен тот факт, что для новорожденных характерна значительная эндотелиальная активация и в норме. Это, по-видимому, поддерживается продукцией ФНО-α моноцитами и способствует миграции лейкоцитов в ткани в условиях физиологического течения неонатального периода. Таким образом, в целом текущие данные подтверждают концепцию более высокой исходной активации неонатального эндотелия, возможно, опосредованной цитокинами, с последующим нарушением регуляции ключевых функций (экспрессия молекул адгезии) в случае развития синдрома системного воспалительного ответа.

Поврежденный или активированный ЭС в значительной степени способствует созданию протромботической среды. У взрослых диссеминированное внутрисосудистое свертывание вносит основной вклад в возникновение и прогрессирование полиорганной недостаточности (ПОН) при сепсисе и септическом шоке наряду с митохондриальной дисфункцией, прямой цитотоксичностью бактериальных токсинов и цитокин-индуцированным апоптозом. ПОН также типична для НС, и активированный/ поврежденный ЭС может играть значительную роль в его патогенезе. В дополнение к стимулированию адгезии лейкоцитов за счет воздействия молекул адгезии активированный эндотелий высвобождает большое количество фактора фон Виллебранда (VWF), способствующего агрегации тромбоцитов, гранулоцитов и моноцитов. Гранулоциты, в свою очередь, высвобождают NETs, а активированные моноциты экспрессируют тканевой фактор, который поддерживает протромботический потенциал посредством образования фибрина.

Активное взаимодействие между поврежденным/ воспаленным эндотелием, тромбоцитами, активированными гранулоцитами, NETs и моноцитами получило название иммунотромбоза. Его биология и системные последствия, а также роль эндотелия в этом процессе еще не исследовались в контексте НС. ЭС, тромбоциты и лейкоциты образуют триаду, которая способствует возникновению и прогрессированию ПОН при неонатальном сепсисе. В этом контексте иммунотромбоз заслуживает целенаправленных исследований для выяснения патогенеза и разработки новых стратегий лечения НС.

КОНЕЧНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ

Несмотря на особую природу неонатального сепсиса и его тяжелые последствия, фундаментальные и трансляционные исследования эндотелиальной функции в раннем онтогенезе в норме и при патологии существенно отстают от исследований у взрослых. Исследования структуры эндотелия у новорожденных различного гестационного возраста, взаимодействий между ЭК, гликокаликсом, патогенами и клетками иммунной системы, а также влияния повреждения эндотелия на течение НС могут определить ключевую связь между сепсисом и полиорганными нарушениями.

Сотрудничество между исследователями и клиницистами в перинатологии имеет основополагающее значение для углубления знаний в области молекулярных путей и иммунологических механизмов, регулирующих дисфункцию эндотелия при НС, а также для разработки новых подходов к терапии, направленных на сохранение и восстановление функций эндотелия, и информирования о них, что может значительно улучшить краткосрочные и долгосрочные результаты в выхаживании новорожденных.