Диагностические технологии в арсенале современной медицинской генетики позволяют обнаружить нарушения последовательности ДНК (мутации) — причину широкого спектра заболеваний у детей. Но при всех успехах геномной медицины в знаниях о генетической природе многих патологических состояний остается немало пробелов. Благодаря уникальному альянсу хирургов и цитогенетиков (изучающих хромосомы), исторически сложившемуся в НИКИ Вельтищева, был разработан новый подход к поиску причин пороков развития половой системы, основанный на хромосомном анализе клеток интраоперационных образцов.

СМЕНА КОНЦЕПЦИИ

Безусловно, актуальные концепции поиска генетических причин болезней у детей эффективны, когда речь идет об определенном генетическом заболевании или синдроме. Фактически задача поиска связи генетических дефектов с клиническими проявлениями сводится к сравнительному анализу выявленных мутаций с теми, что уже ранее были обнаружены в качестве ассоциированных с подобным патологическим состоянием, а также были описаны в научной литературе или индексированы в специализированных базах данных. Альтернативный подход к определению патогенности геномных изменений основан на расширенном биоинформатическом анализе последствий изменений последовательности ДНК. Как правило, он применяется при обнаружения ранее неописанных мутаций и хромосомных аномалий, затрагивающих несколько или даже несколько десятков генов одновременно. Более того, этот подход к определению патогенности геномных изменений представляется наиболее эффективным для определения молекулярных и клеточных механизмов заболевания, поскольку позволяет не только сделать вывод относительно влияния выявляемой генетической вариабельности на клинические проявления болезни, но также и определять процессы-кандидаты заболевания, внешнее воздействие на которые может лечь в основу патогенетического лечения.

Важно уточнить, что данная методология — основополагающая для молекулярной диагностики генетически обусловленных редких (орфанных) заболеваний, преимущественно связанных с мутациями в одном гене (моногенные синдромы). Тем не менее, когда возникает потребность определить генетические причины недифференцированных форм нарушения развития центральной нервной системы — ЦНС (умственная отсталость, аутистические расстройства, эпилепсия) и врожденных пороков развития (ВПР), приходится констатировать, что диагностические процедуры, основанные на актуальных концепциях поиска генетических причин заболевания, не столь эффективны и не позволяют в полной мере идентифицировать каскад или совокупность патологических процессов в организме, вызванных генетическим дефектом.

Представители отечественной школы медицинской генетики вне зависимости от общемировых тенденций и конъюнктуры никогда не отрицали существование межклеточной вариабельности генома (общей совокупности генетического материала) в организме человека, считая, что в нем всегда имеется определенное количество клеток с геномными нарушениями, увеличение которого служит причиной различных патологических процессов на клеточном, тканевом, органном и организменном уровнях. Помимо поиска мутаций, которые поражают все клетки организма, приводя к орфанным или относительно редким заболеваниям, ставилась также задача изучения генетических (хромосомных) аномалий в отдельных клетках (соматический мозаицизм или геномные нарушения только в определенной части клеток) для понимания их роли в этиологии различных заболеваний у детей.

Более того, была выдвинута гипотеза о том, что если нарушения генома в отдельных клетках ограничены определенной тканью (тканеспецифический мозаицизм или тканеспецифическая геномная нестабильность), то именно в ней и будут происходить патологические структурные и функциональные изменения. Так, в серии оригинальных работ российских ученых (в основном под руководством профессоров, заслуженных деятелей науки России Юрия Борисовича Юрова и Светланы Григорьевны Ворсановой) было показано, что соматический мозаицизм и геномная нестабильность, поражающая исключительно клетки головного мозга (или даже его отдельные области), представляют собой частый механизм нейродегенеративных и нервно-психических заболеваний у детей.

Как не сложно догадаться, эти исследования проводились на аутопсийном материале, затрудняя оперативный переход от фундаментального открытия к разработке практических процедур для улучшения состояния пациента. Впоследствии было также выдвинуто предположение о том, что подобные геномные нарушения могут быть связаны не только с заболеваниями ЦНС, но и с другими состояниями, ассоциированными с тканеспецифическими морфологическими изменениями или дисфункцией, например с ВПР. К сожалению, результаты подобных исследований было так же сложно транслировать в практическую (диагностическую) плоскость, как и протестировать гипотезу о том, что тканеспецифические формы генетического мозаицизма и геномной нестабильности могут быть ключевым элементом патогенетического каскада при ВПР.

НОВЫЙ ПОДХОД

Все изменилось, когда в НИКИ Вельтищева две широко известные в нашей стране и зарубежом научные школы детской хирургии и цитогенетики объединили усилия, чтобы исследовать нарушение генома непосредственно в той ткани, в которой возникают патологические изменения из-за ВПР. Это послужило стартом для формирования неординарного альянса детских хирургов и медицинских цитогенетиков (изучающих роль хромосомной патологии в этиологии болезней человека). Было решено провести параллельный анализ геномных/хромосомных вариаций в клетках крови и хромосомной патологии в интраоперационных образцах у детей с крипторхизмом и гипоспадией.

При разработке дизайна работы была де-факто предложена новая концепция поиска генетических причин ВПР. Помимо существующей схемы поиска генетических дефектов в клетках крови была разработана принципиально новая, включающая молекулярно-цитогенетический анализ интраоперационных образцов для выявления тканеспецифической хромосомной нестабильности. Без ложной скромности можно утверждать, что смена концепции полностью себя оправдала. Примечательно также, что исследований генетических причин ВПР в ткани, в которой непосредственно наблюдаются патологические изменения, ранее не проводилось.

ОТ ОРГАНИЗМА К КЛЕТКЕ

Сегодня поиск мутаций (генных и хромосомных), вызывающих ВПР, осуществляется в основном с помощью геномных технологий, которые не позволяют исследовать отдельные клетки организма. Исключение представляет классический цитогенетический анализ, в ходе которого изучается структура и число хромосом отдельных клеток под световым микроскопом. Однако данный метод имеет небольшое разрешение, не позволяя идентифицировать множество хромосомных мутаций. Тем не менее он необходим (а точнее, незаменим) для выявления геномной нестабильности, проявляющейся в виде изменения числа, структуры и морфологии хромосом (хромосомной нестабильности).

Анеуплоидия (наличие дополнительной/лишней хромосомы или ее потеря в клетке) представляет собой, по-видимому, самую распространенную форму соматических мутаций и геномной нестабильности у человека, и ассоциируется с широчайшим спектром болезней от онкологических до аутоиммунных, от генетических синдромов с мультисистемой патологией до бесплодия, от нейродегенеративных до иммунодефицитных. Неудивительно, что соматическая генетика (изучающая генетические изменения в соматических клетках) в первую очередь фокусируется на этой форме нарушения стабильности генома и хромосомной патологии.

При изучении заболеваний, связанных с нестабильностью генома, недостаточно результатов только полногеномного сканирования на предмет мутаций, которое осуществляется на основе анализа среднестатистического генома, сложенного из последовательностей ДНК нескольких сотен тысяч клеток. Для успешного определения молекулярных и клеточных механизмов клинических проявлений заболевания необходимо также применять методы, позволяющие детектировать нарушения генома в различных тканях (типах клеток). На современном этапе развития медицинской генетики сочетание изучения генома отдельного организма вместе с анализом геномной патологии (нестабильности) в отдельных клетках этого же организма является не столько оригинальным дизайном исследования в области фундаментальной биомедицины, сколько диагностической потребностью. Оптимальный способ определения тканеспецифических форм геномной патологии — анализ интраоперационных образцов. Таким образом, альянс хирургов и генетиков, несмотря на свою неординарность, стал результатом естественного развития отечественной медицинской науки, ставящей перед собой амбициозные цели определения причин и разработки методов лечения детских болезней, прогноз течения которых выглядит туманным или даже малоперспективным.

ИССЛЕДОВАНИЕ = ДИАГНОСТИКА

Специфика генетической диагностики такова, что большинство наиболее популярных технологий определения патогенных геномных нарушений и хромосомных аномалий требует существенного научно-исследовательского опыта в области молекулярной генетики, цитогенетики и/или биоинформатики (системной геномики). Между понятиями «цитогенетическое исследование» и «цитогенетическая диагностика» можно поставить не только знак равенства, но и тождества, что также справедливо и для молекулярно-цитогенетического, молекулярно-генетического, биоинформатического исследования-диагностики.

С одной стороны, это создает большую сложность при унификации диагностических процедур и внедрения алгоритмов машинного обучения для повышения продуктивности, а с другой — позволяет в рамках проведения молекулярной диагностики получать информацию, которую не только можно, но и нужно использовать для разработки научно-обоснованной тактики патогенетического лечения. Отсутствие знаний о таком ключевом звене патогенетического каскада болезни, как тканеспецифическая геномная (хромосомная) нестабильность, не позволяет осуществить корректное ведение пациента с ВПР, а также профилактику послеоперационных осложнений, неэффективности лекарственной терапии и развития хронических заболеваний (например, герминогенных опухолей, ассоциированных с пороками развития половой системы). Наши исследования в области соматической генетики крипторхизма и гипоспадии показали, что хромосомная нестабильность в виде анеуплоидии ассоциируется с этими ВПР. Тот факт, что существует фактическая необходимость анализа нестабильности генома в интраоперационных образцах, лег в основу разработки подхода к поиску генетических причин ВПР (рис.).

Практическим результатом исследования стало понимание того, что детям, у которых выявляется хромосомная нестабильность в клетках крови и интраоперационных образцах, требуется молекулярно-цитогенетический и цитогенетический мониторинг для своевременного выявления увеличения уровней геномной/хромосомной нестабильности и профилактики осложнений или развития хронических заболеваний. При наличии специфических форм хромосомной нестабильности (анеуплоидии) только в клетках интраоперационных образцов соответствующий мониторинг затруднен. Однако мы планируем исследование для определения маркеров в виде нарушения генных сетей, обеспечивающих сохранность стабильности генома, которые могут быть использованы для прояснения молекулярных и клеточных механизмов, а также своевременного вмешательства для предотвращения развития хронических заболеваний или тканеспецифической дегенерации. Важно отметить, что выявление тканеспецифической хромосомной нестабильности осуществляется с использованием наборов ДНК-зондов для флюоресцентной гибридизация in situ из оригинальной коллекции наших лабораторий, то есть зависимость от иностранных производителей сведена к минимуму.

Поскольку результаты генетической диагностики активно используются для определения молекулярных и клеточных механизмов заболеваний, а также имеют критическое значение для разработки тактики патогенетического лечения, неуклонно растет потребность в специалистах, успешно сочетающих компетенции в области медико-биологических исследований (генетика) и клинических дисциплин (детская хирургия). Сегодня есть возможность стать таким специалистом в рамках дополнительного профессионального и послевузовского образования (повышение квалификации и аспирантура соответственно). Более того, ежегодно проводятся несколько отечественных научных конгрессов и конференций, а также научно-практических мероприятий, которые дают возможность более детально погрузиться в данную проблематику. В частности, таким мероприятием является Российский конгресс имени академика Ю.Е. Вельтищева «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии. В 2025 году он пройдет в 24‑й раз 22–24 октября в отеле «Холидей Инн» в Сокольниках (Москва, ул. Русаковская, д. 24). На конгрессе системно обсуждаются исследования во всех областях педиатрии и практические аспекты применения новых подходов к поиску генетических причин различных заболеваний у детей.