Современные возможности цитологического метода в онкологической практике

Цитологическое исследование — признанный полноценный метод морфологической верификации патологического процесса. Он позволяет установить диагноз при самых различных заболеваниях — от инфекционных поражений до злокачественных опухолей — на первичном этапе обследования пациента, до начала какого-либо лечения. В качестве отдельной медицинской специальности официально признан в 1941 г. после работ Г. Папаниколау и Н. Траута. К чести нашей страны, разработка цитологического метода диагностики начата в 1938 г. в клинико-диагностической лаборатории Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена. В 1941 г. профессор Н.Н. Шиллер-Волкова на сессии института доложила о первых результатах по исследованию выделений из влагалища, мокроты и пунктатов. И хотя метод технически прост, быстр, сравнительно дешев и малотравматичен, в настоящее время в онкопатологии он недооценен и не используется в полном объеме.

Цитологическое заключение включает: определение гистогенеза новообразований, установление степени дифференцировки опухолевого процесса, уточнение степени распространенности опухоли (выявление метастазов), изучение фоновых изменений, определение некоторых факторов прогноза, возможность исследования бактериальной флоры, цитопатических эффектов вирусов, паразитов. Современное цитологическое заключение не только констатирует наличие злокачественного новообразования, но и указывает гистологический тип опухоли (рак, меланома, лимфома, саркома), степень ее дифференцировки согласно общепринятым международным классификациям (МКБ-О и ВОЗ). В настоящее время в цитоморфологии разработаны и приняты три цитологические классификации: классификация плоскоклеточных поражений шейки матки (Bethesda System, 2001), классификация опухолей щитовидной железы (Bethesda System, 2010) и классификация уринарной патологии (Парижская система, 2016). В них разработаны цитоморфологические критерии оценки различных патологических состояний, представленные в виде категорий, а также показана тактика врача-клинициста в зависимости от полученного заключения.

В развитии цитологии можно выделить три основных этапа: эксфолиативная, в основном гинекологическая цитопатология, аспирационная цитология, бурный расцвет которой начинается с 80-ми годами XX в. и связан с внедрением ультразвуковой диагностики, и современный этап развития, который определяется применением иммуноцитохимических и молекулярных методов исследования, а также автоматизированного скрининга в гинекологической цитологии.

По способу получения материала цитологию можно разделить на дооперационную (эксфолиативную, абразивную, аспирационную) и интраоперационную. Эксфолиативная включает в себя исследование мазков, соскобов, различных выделений и биологических жидкостей. Этот раздел цитологии отличается простотой техники получения большого количества клеток. При таком взятии материала клетки хорошо сохраняются и препараты легко интерпретировать. Абразивная цитология получает материал из определенного участка внутренних органов, в том числе исследуются субэпителиальные поражения с помощью фиброоптических инструментов. Тонкоигольная аспирационная биопсия (ТИАБ) в настоящее время позволяет получить материал практически из любого органа. Метод постоянно совершенствуется и дает оптимальные результаты, что делает его в плане диагностики высокоэффективным и экономичным.

ТИАБ для цитологического исследования впервые была использована Lucatelio в 1895 г. С момента первого использования ТИАБ для диагностики опухолей молочной железы Мартином и Элисом в 1930 г. наблюдался выраженный рост частоты применения данного метода. Однако в последние два десятилетия скрининговая маммография и развитие инновационных биопсийных устройств изменили практику применения этого метода. Первый опыт применения ТИАБ для оценки неопластических процессов печени опубликовал А. Lundquist в 1970 г. На сегодняшний день имеется большой интерес к цитологическому исследованию как малоинвазивному методу морфологического подтверждения диагноза, методу, способному предоставить дополнительную поддержку диагностическому поиску, особенно в тех случаях, когда разрешающая способность гистологического исследования оказывается недостаточной. Однако необходимо отметить, что ценность ТИАБ напрямую зависит от качества полученного образца и профессионализма врача, проводящего забор материала.

За последнее время развитие жидкостных технологий, предложенных в 90-е годы XX в., позволило поднять цитологическую диагностику на другой уровень. Впервые метод жидкостной цитологии был утвержден для использования в гинекологическом скрининге FDA США в 1996 г. для системы ThinPrep2000™ (Hologic Co., USA), а в 1999 году — для системы SurePath™ (TriPath, Becton Dickinson, USA). Параллельно метод стал применяться в цитологической диагностике опухолей. Жидкостная тонкослойная технология — это способ получения монослойных цитологических препаратов при переносе клеток из фиксирующего или транспортного раствора на стекло с использованием различных физических методов: центрифугирования, осаждения и∕или фильтрации.

Результатом данной технологии являются высококачественные стандартизованные цитологические препараты. Это позволило усовершенствовать преаналитический этап работы — длительно хранить, транспортировать материал из отдаленных лабораторий в централизованные, создавать архив и получать тонкослойные цитологические препараты со стандартной областью просмотра.

Жидкостная цитология (ЖЦ) может быть использована для исследования любого клеточного материала, является информативным методом скрининга заболеваний шейки матки, причем может применяться как в сочетании с традиционным способом, так и самостоятельно. Для диагностических исследований ЖЦ не заменяет традиционный метод, а дополняет его. В ряде работ проведено сравнение ЖЦ-препаратов с традиционными мазками и показано улучшение качества цитологической диагностики за счет снижения количества неинформативного материала. Отмечают большие преимущества таких препаратов: клетки располагаются в монослое, сохраняется их архитектоника, уменьшается фон, концентрация клеток в одном месте значительно экономит дорогие сыворотки, улучшается качество иммуноцитохимических (ИЦХ) результатов. Стабилизирующий раствор позволяет сохранить клеточную суспензию для дальнейших контрольных и повторных исследований. Появилась возможность исследования материала дополнительными методами, снижения количества нерепрезентативного материала, применения автоматизированного скрининга. Использование жидкостной цитологии особенно рекомендуется при выполнении ИЦХ-исследований.

Только морфологическое исследование вносит ясность и определяет окончательный план оперативного, лучевого и химиогормонального лечения или позволяет отказаться от него. Среди комплексных методов предоперационной диагностики цитологический метод занимает одно из ведущих мест. Результативность цитологической диагностики высока и составляет 69,4–97,3 %. При использовании традиционного цитологического исследования возникают непреодолимые трудности при установлении гистогенеза отдельных опухолей, определении источника метастазирования, трактовке первично-множественных поражений, определении степени распространенности опухолевого процесса. Так, определение гистологической формы опухолей при использовании только цитологического метода оказывается возможным только в 60–70 % случаев. Учитывая тот факт, что цитологический метод применяется прежде всего как первичное, «долечебное» диагностическое исследование, результаты его во многом определяют дальнейшую лечебную тактику, в связи с чем возникает необходимость в использовании дополнительных уточняющих методов. Незаменимой в таких случаях методикой является иммуноцитохимическое исследование.

Как известно, иммуногистохимия (ИГХ) — это один из методов окраски биологических объектов, изучаемых под микроскопом на гистологических срезах. Он основан на высокоспецифической реакции «антиген — антитело» при изучении гистологических препаратов с целью идентификации и установления локализации в клетках разнообразных молекулярных структур и соединений: иммуноглобулинов, гормонов, ферментов, рецепторов поверхностных мембран, белков промежуточных филаментов. В качестве альтернативы методу ИГХ, когда нет возможности получить гистологический материал, может быть предложен метод определения экспрессии молекулярных маркеров на цитопрепаратах — иммуноцитохимический метод, валидизированный тысячами исследований как за рубежом, так и в нашей стране.

Впервые в России ИЦХ активно стали использовать в онкологии в начале 2002 г. в МНИОИ им. П.А. Герцена, чему во многом способствовало внедрение в цитологию жидкостных технологий. Именно с этого момента ИЦХ-стала самостоятельным вспомогательным методом в цитологической диагностике опухолей. В 2010 г. вышел первый отечественный «Атлас цитологической и иммуноцитохимической диагностики опухолей» под редакцией Н.Н. Волченко и М.В. Савостиковой. Разнообразие МКАТ, используемых в ИЦХ-исследованиях тонкоигольных пунктатов, в каждом конкретном случае позволяет ответить на вопрос, имеет ли данная опухоль эпителиальное происхождение или является саркомой, меланомой, лимфомой. Применение ИЦХ-метода расширяет возможности морфологической диагностики при установлении гистогенеза различных опухолей, позволяя диагностировать рак, меланому и лимфому с точностью до 90,3, 100 и 87,5 % соответственно. В настоящее время ИЦХ-исследование высоко/низкомолекулярных цитокератинов и транскрипционных факторов позволяет определить органоспецифичность метастазов при невыявленном первичном очаге с точностью до 92 %. Степень распространения опухолевого процесса определяет стадию и тактику лечебных мероприятий. По данным литературы, ИЦХ-метод повышает выявление метастатических лимфатических узлов на 22–24 %. Сопоставление результатов экспрессии молекулярных маркеров при ИЦХ- и ИГХ-исследованиях проводилось рядом отечественных и зарубежных исследователей, и получена хорошая корреляция: совпадение результатов ИЦХ- и ИГХ-исследований составило от 61 до 92 %.

Цитологическое исследование — единственный метод диагностики злокачественной природы выпотов, достоверность его вариабельна и составляет от 60 до 96 %. Обнаружение раковых клеток в экссудатах на ранних этапах метастазирования опухоли является очень важной задачей, поскольку установление факта диссеминации опухолевого процесса до проявления клинических признаков заболевания позволяет выбрать оптимальную тактику лечения. Однако разнообразный клеточный состав экссудата — наличие клеток пролиферирующего мезотелия, лимфоидных и гистиоцитарно-макрофагальных элементов, лейкоцитов, а также опухолевых клеток, морфологически сходных с клетками мезотелия, — может являться причиной неуверенных заключений о характере выпота. Для разрешения спорных диагностических ситуаций чаще всего используются МКАТ к поверхностному эпителиальному антигену Ер-САМ (клон Ber-EP4). По данным отечественной литературы, ИЦХ-исследование с применением Ep-CAM на материале выпотных жидкостей позволяет повысить чувствительность и специфичность цитологической диагностики аденокарциномы до 99 %, в 3–7 % — избежать гипердиагностики опухолевого процесса. ИЦХ-исследование плевральных и перитонеальных выпотов в сложных диагностических случаях повышает результативность цитологического метода: чувствительность — с 62 до 93 % и специфичность — с 95 до 99 %. При невыявленном первичном опухолевом очаге сочетание цитологического и ИЦХ-исследований с использованием широкой панели МКАТ в 93 % случаев устанавливает локализацию опухоли при метастазе в серозные полости.

Хотелось бы привести один рядовой клинический случай: в июле 2016 г. к нам обратился мужчина 49 лет. Он принес свой плевральный выпот в объеме 500 мл со словами: «Поставьте мне лимфому». Как мы далее узнали, мужчина обследовался в течение двух месяцев, ему были сделаны МРТ, УЗИ, КТ, клинический и биохимический анализы крови. Были выявлены множественные поражения лимфатических узлов средостения, костного мозга, легких и поставлен диагноз «лимфома». Морфологическая верификация не проводилась. В тот же день было проведено цитоморфологическое и иммуноцитохимическое исследование плеврального выпота с использованием жидкостной цитологии. При анализе цитопрепаратов выпота были выявлены комплексы клеток аденокарциномы (рис. 2), а положительная реакция с МКАТ к цитокератину 7 и TTF1 (рис. 3, 4) показала, что это первич-ная аденокарцинома легкого. Таким образом, в течение одного рабочего дня был поставлен морфологический диагноз.

Одной из разновидностей иммуноцитохимических методов исследования является флуоресцентная иммуноцитохимия (ФИЦХ). Согласно данным литературы, возможности ФИЦХ в дифференциальной диагностике злокачественных новообразований имеют единичные упоминания, в первую очередь связанные с экспресс-диагностикой метастатических выпотов и смывов с серозных оболочек во время оперативного вмешательства, так как метод не требует больших временных затрат и обладает доказанной эффективностью. По нашим собственным данным, интраоперационное применение ФИЦХ с Ep-CAM (Ber-EP4) повышает чувствительность и специфичность цитологического метода при исследовании выпотов и смывов на предмет «рак / не рак» до 100 %. Сегодня отечественными учеными из Нижнего Новгорода разработана тест-система для проведения флуоресцентной иммуноцитохимии на биочипах, позволяющая провести дифференциальную диагностику «рак/не рак» в первичном звене медицинских учреждений (рис. 5, 6). Биочип является высокотехнологичным изделием медицинского назначения, ориентированным на решение различных клинических задач.

В ряде случаев применение ИЦХ-исследований устраняет необходимость использования некоторых инвазивных и дорогостоящих диагностических мероприятий, таких как открытая биопсия, компьютерная томография, магнитно-резонансная томография и др.

Интраоперационная цитологическая диагностика — одно из основных направлений цитологического метода исследования. Во время операции с использованием цитологического метода уточняется характер патологического процесса, степень распространенности с выявлением метастазов в лимфатические узлы, печень и другие органы, производится контроль радикальности выполненной операции с исследованием краев резекции. Сочетание цитологического и гистологического интраоперационных исследований снижает вероятность ошибки и улучшает точность диагностики.

В литературе представлены многочисленные зарубежные работы, посвященные цитологическому исследованию материала клеточных блоков (cell block). L.P.H. Bahrenberg в 1896 г. впервые применил технику заливки осадка в парафин и изучил его в срезах. F.S. Mandelbaum в 1917 г. опубликовал результаты своих исследований жидкостей из серозных полостей с использованием парафиновых блоков. Существует множество методик приготовления клеточных блоков: клеточный блок AgarCyto (Olson et al., 1986 г.; Kong et al., 1990 г.), набор Shandon Cytoblock, клеточный блок на основе желатина, автоматизированная система Cellient (Hologic, США). На сегодняшний день применение клеточных блоков — это обычная процедура в цитопатологии, имеющая большое значение как дополнение к традиционному цитологическому исследованию выпотных жидкостей, позволяющая не только архивировать клеточный материал, но и проводить проспективные и ретроспективные морфологические, иммуноцитохимические и цитогенетические исследования на недоступном патологу материале. В отечественной литературе в 2013 г. впервые была представлена работа Н.Н. Волченко и соавт. с данными о применении клеточных блоков из осадков серозных экссудатов и соскобов с опухолей молочной железы.

Одним из путей совершенствования цитологического метода исследования является применение морфометрии, что позволяет получать объективные количественные параметры. Например, при обработке на компьютере выделены наиболее информативные морфометрические признаки, относящиеся к параметрам ядра, с использованием основных диагностических морфометрических признаков: площади, периметра, оптической плотности, коэффициента поляризации ядер, числа ядрышек, их площади и периметра. Разработаны объективные морфометрические признаки различных степеней дисплазии при дисгормонально-гиперпластических процессах молочной железы, шейки матки, что уменьшило долю субъективизма в определении различных степеней дисплазии. Развиваются новые методы микроскопии: фазово-контрастная, флюоресцентная, конфокальная и т.д.

Создание компьютерных программ обучения, развитие метода телеконсультации предъявляют новые требования и способствуют развитию и совершенствованию цитологической диагностики. Стремительное развитие информационных и интернет-технологий позволяет нам ставить перед собой более масштабные задачи. В процессе решения этих задач появились сканирующие цифровые микроскопы и сканирующие системы.

Телемедицина — метод оказания своевременной квалифицированной помощи там, где время, качество, расстояние являются критическими факторами. По данным литературы, точность телецитологических заключений в диагностике онкопатологии достигает 95 %. В медицинских кругах XX столетие названовеком цитопатологии. Оценивая возможности цитологического метода, можно сказать, что есть еще перспективы его развития в комбинации с другими дисциплинами и методами. К сожалению, высокий уровень цитологической диагностики пока остается прерогативой ведущих онкологических учреждений (МНИОИ им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, г. Москва; ФГБУ «Центральная клиническая больница с поликлиникой» УДП РФ, г. Москва; ФГБУ РНЦРР Минздрава России, г.Москва; МРНЦ им. А. Ф. Цыба — филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, г.Обнинск). Сегодня мы прилагаем все усилия для изменения этой ситуации и повышения уровня цитоморфологической диагностики по всей стране: проводим обучающие школы, семинары, конференции.