Микробиологические аспекты в перинатальной медицине и педиатрии: что нового?

Человек — это сложнейший организм, включающий симбиотическое сообщество многочисленных эукариотических клеток и различных микроорганизмов (бактерий, археев, вирусов, грибов, простейших), оптимальное соотношение и взаимодействие которых в значительной степени определяют состояние его здоровья.

До недавнего времени для изучения качественных и количественных параметров микробиоты использовались исключительно методы, основанные на культивировании микроорганизмов. В последние два десятилетия технологический прогресс в области секвенирования ДНК привел к настоящей революции в исследовании микробиома человека, где были достигнуты значительные успехи и более четко определена роль микробиоты в поддержании здоровья и развитии заболеваний.

Простота использования и невысокая себестоимость секвенирования ампликонов 16S рРНК привели к тому, что их стали применять для анализа всех образцов, в том числе взятых из органов, которые изначально считались стерильными, таких как плацента и развивающийся плод. Высокая чувствительность этих методов позволила обнаружить фрагменты ДНК, характерные для бактерий. Это вызвало большой интерес, но было неоднозначно принято разными исследователями — началась полемика, которая продолжается и сейчас. Сегодня для комплексного изучения сложного симбиотического сообщества все чаще используются разнообразные молекулярные технологии, такие как секвенирование нуклеиновых кислот и масс-спектрометрия с последующим биоинформатическим анализом, что позволило получить новую информацию о разнообразии трудно культивируемых и некультивируемых групп микроорганизмов.

Микробиом кишечника содержит все три домена клеточной жизни: бактерии, археи и эукариоты, а также вирусы, хотя и в очень разных относительных концентрациях. Бактерии и археи составляют более 99 % уникального охарактеризованного генного репертуара и биомассы. Численность таксонов велика: она насчитывает более 650 родов и до 4650 видов бактерий (только в кишечнике), относящихся к 9 различным типам (филам) домена Вacteria, часто трудно культивируемых облигатных анаэробов. У одного человека выявляется до 160 численно превалирующих видов микроорганизмов с общей концентрацией, превосходящей 1011 клеток на один грамм кишечного содержимого. Из них около 90 % суммарно составляют бактерии типов Bacillota (семейства Ruminococcaceae и Lachnospiraceae), а также Bacteroidota dota (семейства Bacteroidaceae, Prevotellaceae и другие).

Подавляющее большинство (>99 %) этих микроорганизмов находится в дистальных отделах желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Из сотен родов микроорганизмов, которые могут входить в состав микробиоты толстого кишечника, около 20 встречаются более чем у 95 % людей. Они занимают различные экологические ниши в просвете кишечника и на поверхности слизистой оболочки, формируя сложные сети биохимических взаимодействий между собой и с организмом хозяина. Динамическое равновесие микробиома кишечника необходимо для нормальной физиологии организма. Например, кишечные микробы участвуют в метаболических процессах, стимулируют нормальное развитие иммунитета и функций мозга на ранних этапах онтогенеза, обеспечивают барьерную защиту от патогенов и поддерживают баланс.

В меньшем количестве в кишечной микробиоте присутствуют бактерии типов Actinobacteraeota, Pseudomonadota и Verrucomicrobiota. Наряду с бактериями в толстой кишке встречаются метаногенные археи (например, рода Methanosphaera). Археи сочетают свойства бактерий (кольцевая хромосома) и эукариотов (сходные молекулярные механизмы репликации ДНК), составляя 0,8 % тотальной ДНК в количестве 108–10/г фекалий. В незначительных концентрациях в составе микробиоты могут обнаруживаться дрожжеподобные грибы (род Candida) или другие одноклеточные эукариоты (род Blastocystis).

Недавние исследования продемонстрировали роль грибов и простейших — микробных эукариотов, составляющих хотя и меньшую, но потенциально важную часть микробиома кишечника.

ЗАКОН РАЗНООБРАЗИЯ

Разнообразие микробного состава столь велико, что понятие нормы качественного и количественного состава микробиоты толстого кишечника пока еще не определено. Путь формирования микробиоты толстого кишечника, начинающийся сразу после рождения, столь же индивидуален, как и ее состав у взрослого человека. В первые дни или недели жизни в кишечной микробиоте новорожденного часто наблюдается преобладание факультативно анаэробных бактерий, таких как Escherichia coli. Затем у большинства детей на первое место по численности выходят бактерии рода Bifidobacterium, специализирующиеся на переработке олигосахаридов молока. Бифидобактерии у детей доминируют среди сахаролитических бактерий (преобладающие виды — B. longum, B. bifidum, B. breve).

До введения прикорма в рационе грудных детей отсутствуют пищевые волокна. Однако материнское молоко содержит более 200 видов олигосахаридов, среди которых наиболее высока концентрация трисахарида 2’-фукозил-лактозы. Эти углеводы представляют собой питательный субстрат для формирующейся микробиоты ребенка и стимулируют главным образом размножение Bifidobacterium, характерное для ранней микробиоты.

Основными источниками энергии для микроорганизмов толстого кишечника являются сложные углеводы растительного и животного происхождения, а также вырабатываемый бокаловидными клетками муцин. В ходе последующих месяцев микробиота будет постепенно созревать, расширяя разнообразие облигатно анаэробных представителей типов Bacillota или Bacteroidetes (Bacteroidota) по мере введения прикорма и постепенного отказа от грудного молока или молочных смесей.

Основным путем катаболизма данных субстратов является брожение, сопровождающееся выработкой короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК). Важнейшие представители данной группы веществ — масляная, пропионовая и уксусная кислоты. Они эффективно всасываются в кишечнике, и только 5–10 % их общего количества выделяется с испражнениями.

Так, вырабатываемая интестинальной микробиотой масляная кислота служит основным источником энергии для колоноцитов, обладает общим противовоспалительным эффектом, связанным со снижением активности универсального фактора транскрипции NF-kB. КЦЖК осуществляют дозозависимое ингибирование деацетилаз гистонов, что приводит к широкому спектру низкоспецифических эффектов.

Существует множество исследований, посвященных применению пробиотических штаммов микроорганизмов для профилактики и лечения заболеваний человека. В частности, показана способность пробиотиков предотвращать развитие тяжелых форм некротизирующего энтероколита, а также снижать частоту возникновения антибиотик-ассоциированной диареи у детей.

ТЕМНАЯ МАТЕРИЯ

Хотя изучению бактериальных компонентов микробиома уделяется значительное внимание, о составе и физиологической значимости популяций бактериофагов, связанных с кишечником человека (фагома), известно немного.

В последние годы был введен термин «вирусная темная материя» для описания недостающего объема знаний о таксономическом составе и популяционной структуре кишечного фагома. Общее количество бактериальных вирусов в фекалиях человека, содержимом слепой кишки и слизистой оболочке толстой кишки человека составляет свыше 1012: эти вирусы играют важную роль в регулировании сложных микробных сетей. В основном речь идет о представителях отряда Caudovirales, семейств Siphoviridae, Podoviridae и Myoviridae. Основным методом изучения некультивируемых вирусных сообществ кишечника является глубокое секвенирование с использованием высокопроизводительных технологий на основе коротких считываний. Помимо бактериофагов постоянно обнаруживаются скрытые ДНК-вирусы человека и микроэукариотов (Circoviridae и Genomoviridae), а также Herpesviridae и Papillomaviridae человека.

Виром — одна важнейших составляющих микробиоты. Бактериофаги регулируют бактериальный микробиом посредством переноса генов, вызывая гибель конкурентных микрорганизмов, и позволяют бактериям, содержащим профаг, занять определенную нишу. Высокая концентрация фагов в муцине, прилегающем к эпителиальным клеткам, обеспечивает дополнительный барьер против бактериальной колонизации, который наиболее высок в верхнем слое муцина, где происходит взаимодействие с возбудителем.

Чем глубже слой муцина, тем меньше бактерий. Лизогенная инфекция, развивающаяся на апикальной поверхности муцинового слоя, потенциально может способствовать горизонтальному переносу генов и лизогенной конверсии комменсальных бактерий. Барр и соавт. (2013) обнаружили, что бактериофаги, ассоциированные с хозяином, могут специфически связываться с муциновыми выделениями и накапливаться в них. Это связывание опосредуется иммуноглобулиноподобными (Ig) капсидными белками, связывающимися с остатками гликанов в гликопротеинах муцина. Полученная в результате модель иммунитета, опосредованного бактериофагами, была названа BAM (прилипание бактериофага к слизи). Наблюдения за образцами слизистой оболочки толстой кишки показали более высокие уровни колонизации бактериофагами по сравнению с фекалиями и содержимым слепой кишки.

Единственная группа РНК-вирусов, постоянно обнаруживающаяся в здоровом кишечнике, — растительные вирусы, принадлежащие к семейству Virgaviridae. Эти вирусы пищевого происхождения способны сохранять инфекционность при прохождении через ЖКТ человека. Вирусы археев включают в себя некоторые морфотипы, общие с бактериофагами, а также необычные типы, характерные для архея.

Принято считать, что новорожденные появляются на свет стерильными, поэтому в их кишечнике не должно быть бактериальных вирусов. Сообщалось о быстрой колонизации кишечника в первые дни жизни динамичной совокупностью бактериофагов. Фагоценоз кишечника новорожденных сложен и относительно нестабилен, так как в нем еще мало микроорганизмов-хозяев. При прямом подсчете с помощью эпифлуоресцентного микроскопа в меконии не было обнаружено никаких вирусных частиц. Однако к концу первой недели на грамм влажной массы кала приходилось около 108 вирусных частиц.

Постепенное созревание микробиома кишечника младенцев приводит к снижению численности и разнообразия вирусов, что сопровождается увеличением численности и разнообразия бактериального компонента. Первоначальный источник вирусов в кишечнике младенцев неизвестен, хотя возможно их попадание с пищей, из окружающей среды и от матери. Кроме того, самые ранние фекальные вирусы младенцев могут быть результатом индукции профагов из недавно колонизированной микробной флоры.

У каждого человека — свой уникальный набор кишечных бактериофагов. Однако у здоровых людей есть общий набор консервативных бактериофагов, которые отличаются по типу, количеству и распространенности от тех, что встречаются у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК).

Наиболее заметное различие между вирусными сообществами взрослых и младенцев заключается в том, что у младенцев их разнообразие намного ниже, что коррелирует с низким разнообразием микроорганизмов в их кишечнике.

Дисбиоз сообщества фагов характеризуется сдвигом в активированном сообществе профагов или увеличением числа литических фагов.

Понимание того, как устроена популяция вирусов в кишечнике младенцев, будет становиться все более важным по мере того, как пре- и пробиотики будут все чаще использоваться для воздействия на развивающуюся микробиоту кишечника.

Виром кишечника человека индивидуален и стабилен, в нем преобладают бактериофаги, он формируется вскоре после рождения параллельно с прокариотическими сообществами микробиоты и окончательно устанавливается в течение первых нескольких лет жизни. Заражая определенные популяции бактерий, фаги могут изменять структуру микробиоты, убивая клетки-хозяева или изменяя их фенотип, что позволяет фагам участвовать в поддержании гомеостаза кишечника или микробного дисбаланса (дисбиоза), а также в развитии хронических инфекционных и аутоиммунных заболеваний, включая ВИЧ-инфекцию и болезнь Крона соответственно.

Наши представления о кишечном вироме фрагментарны, а для получения более полной картины вирома необходимы стандартизированные методы выделения и секвенирования вирусов. Это важно для понимания связи между виромом и заболеваниями, а также того, как кишечные вирусы могут влиять на этиологию заболеваний и быть рациональными мишенями для вмешательств.

КОРРЕКЦИЯ МИКРОБИОТЫ

Пробиотики — это живые микроорганизмы, которые при приеме в достаточном количестве обеспечивают благоприятный для здоровья эффект. С этой целью применяются представители нормальной микробиоты, характеризующиеся практически нулевой патогенностью и относительной легкостью культивирования (в частности, представители родов Lactobacillus и Bifidobacterium). Жизнеспособность пробиотика является решающим фактором. Существует ряд исследований, посвященных применению пробиотических штаммов микроорганизмов для профилактики и лечения заболеваний. В частности, показана способность пробиотиков предотвращать развитие тяжелых форм некротизирующего энтероколита, а также снижать частоту возникновения антибиотик-ассоциированной диареи у детей.

Одним из перспективных методов коррекции в последние годы считается фекальная трансплантация, которая, впрочем, не лишена недостатков. В фекальных трансплантатах только половина бактерий сохраняют жизнеспособность после высокоскоростной гомогенизации фекалий. Доминирующие анаэробные кишечные комменсалы (в том числе Faecalibacterium prausnitzii, Eubacterium rectale, Anaerobutyricum hallii), вносящие основной вклад в биосинтез бутирата, очень чувствительны к действию кислорода, поэтому погибают при гомогенизации. Оптимальным решением для коррекции микробиоты следует считать создание контролируемой композиции из доминирующих бутират-продуцирующих бактерий.

Кандидатами для будущих пробиотических препаратов, имеющих особое значение в педиатрической практике, следует считать Anaerobutyricum hallii (ранее Eubacterium hallii), относящиеся к типу Bacillota, семейству Lachnospiraceae, грамположительные палочки-анаэробы. А. hallii способны взаимодействовать с Bifidobacterium infantis уже в первые месяцы жизни ребенка. Они могут осуществлять ферментацию промежуточных продуктов расщепления олигосахаридов грудного молока с образованием КЦЖК, что оказывает положительное воздействие на детский организм и способствует благоприятной колонизации кишечника младенца. А. hallii могут вырабатывать бутират из лактата и ацетата и превращать 1,2‑пируват в пропионат (КЦЖК), что предотвращает накопление лактата в толстой кишке. А. hallii — это один из первых продуцентов бутирата в кишечнике младенцев. Перспективный новый препарат на основе A. hallii может быть использован и для профилактики или лечения осложнений, связанных с инсулинорезистентностью, синдромом короткой кишки или ВЗК, колоректального рака.