Среди направлений медицинской науки последних лет важное место занимает адаптация для клинического применения различных биомаркеров, изменения которых характерны для тех или иных заболеваний. Одна из наиболее перспективных в этом отношении молекул — свободно циркулирующая, или внеклеточная ДНК (сцДНК)1 . В этом материале рассказывается о ее роли при сердечно-сосудистой патологии.

ЧТО ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ сцДНК 

Наличие сцДНК в крови впервые установили французские ученые П. Мандель (P.Mandel) и П.Метэ (P.Métais) в 1948 г.—еще до открытия химической структуры нуклеиновых кислот. Это сильно фрагментированная двухцепочечная ДНК, присутствующая во внеклеточных средах: плазме/сыворотке, моче, слюне, ликворе, синовиальной и перитонеальной жидкостях. Такие фрагменты существуют в составе внеклеточных органелл (включая экзосомы), комплексов с другими веществами, а также в свободном виде. Понятие «внеклеточная ДНК» может также включать циркулирующую митохондриальную ДНК. Сходная с бактериальной молекулой, при нарушении аутофагии она может выступать провоспалительным фактором. Имеются данные о ее существенной роли в повреждении кардиомиоцитов. 

Значительная часть сцДНК является результатом клеточной гибели. При апоптозе ядерная ДНК расщепляется ферментом ДНКазой, и в дальнейшем фрагменты нуклеиновой кислоты не подвергаются воздействию макрофагов. Некроз в норме вносит меньший вклад в количество сцДНК, увеличивая его при интенсивных продолжительных стрессах, тяжелых травмах. «Некротическая» сцДНК обнаруживается в виде более длинных—>10 тыс. пар нуклеотидов (т.п.н.)—участков в отличие от «апоптотической» (~150 п.н.). Дифференцировать их можно в полимеразной цепной реакции (ПЦР). 

Существуют и другие пути высвобождения внеклеточной ДНК. Так, при нетозе нейтрофилы формируют внеклеточные нейтрофильные ловушки (англ. neutrophil extracellular trap, NET; отсюда название NETosis) —сетеподобные структуры, задача которых состоит в дезактивации экзогенных патогенов. Последующая гибель нейтрофилов сопровождается выбросом ДНК, гистонов, ферментов и других белков во внеклеточное пространство. Нетоз может иметь патологический характер, способствуя возникновению тромбоза, кардиоваскулярных и других (в т.ч. онкологических) заболеваний. 

Частично сцДНК образуется в результате секреции нормальными и опухолевыми клетками. Еще в 1972 г. доказан факт активного выделения ДНК лимфоцитами во внеклеточную среду. Наконец, по мнению некоторых исследователей, вероятным источником сцДНК в крови может быть ДНК, ассоциированная с мембраной диплоидных лимфоцитов человека. Этот тип цитоплазматической ДНК, открытый в 1971 г., до сих пор изучен недостаточно. Предположительно, из таких молекул может формироваться некоторый объем сцДНК, отличающейся по своим свойствам от ядерной и митохондриальной (ТуаеваН.О., АбрамоваЗ.И., 2007). 

Интенсивное высвобождение сцДНК посредством экзосом, нетоза или везикулярного транспорта связано с активацией иммунных клеток, повышением концентраций цито-, хемокинов и матриксных металлопротеиназ (ММП). В 2018 г. экспериментально установлено, что при ВИЧ-инфекции у нечеловекообразных приматов происходит гиперактивация нейтрофилов и механизмов нетоза. В результате развивается массивная гибель CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, В-клеток и моноцитов, захваченных нейтрофильными сетями, и формируется сопутствующая сердечнососудистая патология. 

В норме содержание внеклеточной ДНК возрастает при физических нагрузках и у пожилых лиц. На фоне заболеваний сердца и сосудов, включая артериальную гипертензию (АГ), ишемическую болезнь сердца (ИБС) (инфаркт миокарда (ИМ), острый коронарный синдром (ОКС)), хроническую сердечную недостаточность (ХСН), а также при инсульте и венозной тромбоэмболии (ВТЭ) сцДНК может высвобождаться из поврежденных тканей. До настоящего времени окончательно не ясно, в какой степени этот процесс является частью патогенеза, а в какой—служит индикатором выраженности болезни. Вероятнее всего, при каждой нозологической форме это соотношение различно. 

Для сцДНК в целом характерно преобладание пар гуанин–цитозин (ГЦ), более устойчивых к разрушению нуклеазами по сравнению с аденин-тиминовыми участками. Наличие АГ, ИБС, сопровождающихся активацией клеточной гибели, ведет к увеличению содержания ГЦ-богатых маркерных последовательностей во внеклеточной ДНК в ≥10 раз. Детекция таких фрагментов и выделение подтипов сцДНК со специфическими характеристиками могут нести важную диагностическую информацию и иметь существенное прогностическое значение. 

На рисунке суммированы важнейшие механизмы участия сцДНК в развитии болезней системы кровообращения. 

сцДНК И АРТЕРИАЛЬНАЯ ГИПЕРТЕНЗИЯ 

В ряде исследований подтверждено, что одной из независимых детерминант повышенного уровня внеклеточной ДНК выступает неоптимально контролируемая АГ. Избыток нуклеотидных фрагментов связан с множественными кардиометаболическими факторами риска. Это усиление системного неспецифического воспаления (высокие уровни С-реактивного белка (СРБ), провоспалительных цитокинов—интерлейкина (IL) 6 и фактора некроза опухоли альфа (TNF-α)), окислительный стресс, значительные концентрации холестерина липопротеинов низкой плотности и триглицеридов, а также более высокое систолическое артериальное (АД) и пульсовое давление. Повреждение геномной ДНК на фоне оксидативного стресса может способствовать увеличению общего пула сцДНК в кровотоке с последующей эндотелиальной дисфункцией (ЭД) и ростом АД. 

Показано, что у пациентов с АГ, коморбидных по сахарному диабету, большие кон ́ - центрации сцДНК могут быть ассоциированы со снижением эластичности стенок артерий. У женщин в постменопаузе, не получающих заместительную гормональную терапию, избыточное содержание сцДНК также указывает на более высокие индекс артериальной жесткости, модуль упругости Юнга и меньшую податливость сонной артерии. Наряду с этим присутствуют проявления системного воспаления, нарушение метаболизма глюкозы и повышенное АД (JylhavaJ. и соавт., 2014). 

В исследовании О.В. Мячиной и соавт. (2024) из 20 пациентов с АГ II стадии, 20 — III стадии и 20 условно здоровых (контрольная группа) у всех установлено наличие в плазме крови сцДНК и кислоторастворимых нуклеотидов. Среди больных с АГ II–III стадий содержание сцДНК оказалось достоверно (p <0,05) более высоким в сравнении с практически здоровыми. Эти и другие данные указывают на то, что повышенный уровень сцДНК может свидетельствовать о сохраняющейся ЭД. Таким образом, определение этого маркера может служить опцией мониторинга АГ на молекулярном уровне. 

сцДНК И АТЕРОСКЛЕРОЗ 

Японскими учеными (в частности, M. Ishida и соавт., 2022) продемонстрировано, что внеклеточная ДНК способствует персистированию воспалительных реакций в стенках артерий в результате опосредованного высвобождения IL-6 и TNF-α. Вследствие этого дополнительно активируется образование атеросклеротических бляшек. Кроме того, обнаружено, что увеличение содержания циркулирующих комплексов ДНК–миелопероксидаза специфично для активации нейтрофилов у страдающих тяжелым коронарным атеросклерозом (BorissoffJ.I. и соавт., 2013). Поэтому сцДНК может быть не только диагностическим маркером, но и потенциальной терапевтической целью. Одним из возможных направлений лечения может стать блокирование рецепторов, активируемых сцДНК, с последующим снижением выраженности воспаления и замедлением развития и/или прогрессирования атеросклероза. 

сцДНК И ИШЕМИЧЕСКАЯ БОЛЕЗНЬ СЕРДЦА 

Содержание сцДНК с учетом времени высвобождения значительно возрастает при ИМ в первые 2 ч после появления загрудинных болей, а у перенесших его может регистрироваться выраженный (вплоть до 50-кратного) рост концентрации внеклеточной ДНК по сравнению со здоровыми. При этом кардиотропонин обнаруживается в плазме уже через 6 ч после ИМ, а повышенный уровень этого маркера может сохраняться до 14 ч. В то же время сравнение количества тропонина и кардиоспецифической сцДНК в 57 образцах миокарда пациентов с ИМ показало сильную связь между обоими параметрами (p <0,0001). Большинство (79 %) исследованных фрагментов тканей были положительными как на тропонин, так и на кардиоспецифическую сцДНК, 7 % — отрицательными в обоих случаях; в 11 % образцов наблюдалась изолированная положительная реакция на тропонин, а в 4 %—слабоположительная реакция только на сцДНК (ZemmourH. и соавт., 2018). 

У больных с ИМ показатели внеклеточной ДНК в различной степени коррелируют со значениями других биомаркеров некроза: МВ-изофермента креатинфосфокиназы (МВ-КФК), СРБ, а также с изменениями фракции выброса (ФВ). Это явление может указывать на зависимость объема высвобождаемой сцДНК от тяжести миокардиального повреждения. Тот факт, что содержание кардиоспецифической сцДНК оказывается повышенным при ИМ с нормальным (<200 мкг/л) уровнем МВ-КФК, свидетельствует о большей чувствительности рассматриваемого теста. Вероятно, внеклеточная ДНК может быть более отчетливым и информативным параметром, чем некоторые из используемых в настоящее время. При этом быстрые изменения ее концентрации (в соответствии с периодом полувыведения 4–30 мин) являются в данном случае важным для ургентной медицины преимуществом, позволяя оценивать непосредственную эффективность того или иного вмешательства в минимальном временном промежутке. ́ 

сцДНК И ХРОНИЧЕСКАЯ СЕРДЕЧНАЯ НЕДОСТАТОЧНОСТЬ 

В случае наличия ХСН, также сопровождающейся апоптозом и некрозом кардиомиоцитов, характер изменений сцДНК во многом зависит от характера основного заболевания. В настоящее время изучаются главным образом молекулярные нарушения при сердечной недостаточности на фоне ИБС (ИМ, коронарный атеросклероз). Традиционно в качестве основного лабораторного показателя ХСН рассматривается концентрация мозгового натрийуретического пептида NT-proBNP. Однако этот параметр не обладает абсолютной специфичностью и может меняться при различных состояниях: заболеваниях почек, ожирении, на фоне химиотерапии, а также с возрастом. Одновременное же использование нескольких маркеров повышает диагностическую точность исследования. T.Yokokawa и соавт. (2020) анализировали у пациентов с ХСН уровни общей сцДНК и ее кардиоспецифической фракции, содержание которой было значительно повышенным в группе больных в сравнении со здоровыми добровольцами; при этом данный показатель коррелировал с уровнем тропонина, но не NT-proBNP. 

Величина ФВ также служит критерием тяжести ХСН, однако корреляция между сцДНК и NT-proBNP у лиц со сниженной ФВ демонстрирует необходимость учета сократительной способности миокарда для более точной оценки взаимосвязи лабораторных и инструментальных показателей. В проспективном наблюдательном исследовании, проведенном Е.В.Колесниковой и соавт. (2023), приняли участие 67 больных (41 мужчина, 26 женщин) с ХСН; 23 человека без диагностированных хронических заболеваний составили контрольную группу. Во всех случаях определяли характер липидного профиля, значения глюкозы и креатинина сыворотки, NT-proBNP и внеклеточной ДНК. Установлены статистически значимые различия в концентрации сцДНК в крови при разной ФВ (<40, 40–49 и >50 %). Выявлена обратная зависимость между показателями сцДНК и ФВ, с одной стороны, и уровнями NTproBNP и ФВ—с другой. Кроме того, доказано положительное влияние медикаментозного лечения на содержание сцДНК и NT-proBNP в группе с ФВ <40 %. Таким образом, прогрессирующее снижение сократительной способности сердечной мышцы сопровождалось сочетанным повышением исследуемых маркеров, что отражало тяжесть состояния больного. 

сцДНК И КАРДИОТРАНСПЛАНТАЦИЯ 

Изучение внеклеточной ДНК у реципиентов сердца направлено на мониторинг состояния трансплантата и раннее выявление реакций отторжения. При этом речь идет о донорспецифической сцДНК. Так, по данным О.Е. Гичкун и соавт. (2023), у 5 исследуемых с морфологическими признаками отторжения (острого клеточного, гуморального и хронического) доля донорспецифической сцДНК в плазме составила от 0,01 до 5,0 %. К более отдаленной перспективе относится ранняя диагностика посттрансплантационных осложнений инфекционного характера — инвазивных микозов, эндокардитов и др. 

сцДНК И ВЕНОЗНАЯ ТРОМБОЭМБОЛИЯ 

Содержание сцДНК коррелирует с параметрами коагуляции и потребления тромбоцитов, а также с маркерами клеточного повреждения и размерами ишемических поражений, что подтверждает возможное значение внеклеточной ДНК как суррогатного маркера тромбообразования. Кроме того, это позволяет предположить, что сцДНК при ВТЭ происходит не из нейтрофильных ловушек, а высвобождается из поврежденных органов (M.Jiménez-Alcázar и соавт., 2017). 

В исследование Y. Zhang и соавт. (2022) вошли 107 пациентов с ВТЭ, проходивших лечение в больнице г. Шицзячжуан (КНР) с мая 2019 г. по май 2021 г. Контрольную группу составили 110 условно здоровых. Сравнивали показатели плазменной сцДНК между группами и у больных с разной степенью тяжести болезни. Уровни внеклеточной ДНК в группе заболевания были более высокими, чем в контрольной (p <0,05). Содержание сцДНК в группах умеренного и тяжелого течения превышало таковое среди участников с легким течением болезни, а концентрация внеклеточной ДНК при тяжелом течении ВТЭ была выше, чем при умеренном (p <0,05 для всех случаев). Наконец, уровень сцДНК положительно коррелировал с тяжестью ВТЭ (p <0,05). По мнению авторов, полученные данные могут служить основой для оценки тяжести течения заболевания. 

сцДНК И СОСУДИСТЫЕ ПОРАЖЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА 

Установлено, что при ишемическом инсульте (ИИ) продолжающаяся гибель клеток в зоне ишемии ведет к выбросу ими молекул и фрагментов ДНК в интерстициальное пространство. Концентрация внеклеточной ДНК у таких больных достоверно (p <0,001) повышается непосредственно в день сосудистого события. Изменения уровня сцДНК позволяют статистически значимо (p <0,001) дифференцировать ИИ с инсультоподобными состояниями (судороги, осложненная мигрень и др.), при которых имеется патологическая неврологическая симптоматика (O’Connell G.C. и соавт., 2017). В экспериментах показана связь между количеством внеклеточной ДНК и объемом повреждения мозга, имеющая достоверный характер (p <0,0001) (VajpeyeeA. и соавт., 2018). Важно также, что накопление в крови сцДНК при некрозе клеток способно ухудшать состояние гемореологии и течение процессов тромболизиса. 

Долгосрочные (≥3 мес) неврологические исходы коррелируют с концентрацией сцДНК после реканализации окклюзированной артерии. Нужно учитывать, что возобновление кровотока нередко приводит к реперфузионному синдрому с дополнительным повреждением ткани мозга и структур гематоэнцефалического барьера, а это, в свою очередь, может потенцировать рост содержания сцДНК в плазме. 

сцДНК И ДРУГИЕ БОЛЕЗНИ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ 

Предстоит изучить значение определения сцДНК при миокардитах и перикардитах различной этиологии, миокардиодистрофиях, пороках сердца и др., равно как и после кардиохирургических операций (в т.ч. в педиатрической практике). Достижения в этой области до настоящего времени не столь значительны и связаны преимущественно с экспериментальными исследованиями. 

ПРОБЛЕМЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 

На сегодняшний день используется ряд методик выделения и количественной оценки внеклеточной ДНК: спектрофотометрическое/флуориметрическое определение ее концентрации, количественная ПЦР, выделение из плазмы с помощью колонок или органических растворителей. С целью повышения диагностической эффективности разработаны технологии капельной цифровой ПЦР и секвенирования нового поколения. 

Тем не менее количественное определение сцДНК в клинической медицине пока используется весьма ограниченно. Имеющиеся результаты свидетельствуют о том, что внеклеточная ДНК в значительной степени сохраняет статус кандидатного биомаркера. Этому во многом способствуют разноречивые данные об условно нормальном количестве плазменной сцДНК. Приводятся значения, характеризующие содержание сцДНК по отношению к условной норме, варьирующие от нескольких нг/мл до ~1200 нг/мл. На вариабельность концентрации сцДНК влияют особенности забора биоматериала, значительная вариативность образцов на этапах экстракции и очистки, условия хранения и др. (Herman D.S. и соавт., 2017). В дополнение к этому, как уже указывалось, содержание сцДНК у здорового человека может увеличиваться в несколько раз в зависимости от физической/эмоциональной нагрузки, возвращаясь через некоторое время (~60 мин) к исходной величине. Поэтому разработка и внедрение стандартов анализа внеклеточной ДНК требуют пристального внимания исследователей. Помимо этого, непосредственный анализ сцДНК сопряжен с достаточно высокой стоимостью процедуры, и эту проблему также предстоит решать в ближайшем будущем. 

Существенным шагом может стать разработка мультимаркерной диагностической панели (в первую очередь для ИМ и ХСН), включающей наряду с определением МВ-КФК и кардиотропонина показатели сцДНК. Такой тест дополняет клиническую информацию данными о воспалительном статусе пациента. Применение подобной панели позволит также рационально использовать различия в темпах высвобождения и клиренсах этих биомолекул. При этом необходимо учитывать имеющиеся преимущества и ограничения каждой методики (таблица). 

В ЗАКЛЮЧЕНИЕ 

Изучение связи внеклеточной ДНК и течения сердечно-сосудистых заболеваний важно во многих отношениях, включая развитие персонализированной медицины и реализацию пациентоориентированного подхода. Дальнейшая исследовательская работа и клинические испытания должны содействовать повышению роли сцДНК как полноценного биологического маркера с соответствующей диагностической и прогностической значимостью. 

Юрий Никулин, к.м.н

Список литературы находится в редакции